聚球藻Synechococcus sp.中活性物質(zhì)分離及活性研究

趙小惠，孫利芹，劉紅輝，汲紅麗，衛(wèi) 東

煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺 264005

天然產(chǎn)物始終是新藥的源泉，作為海洋的初級生產(chǎn)者和海洋生物種屬的主體，海洋微藻在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著重要作用，獨(dú)特的生存環(huán)境和原始地位賦予了微藻多種新穎獨(dú)特的具有生物活性的代謝產(chǎn)物，并具有生長快、產(chǎn)量高、可定向培養(yǎng)、易調(diào)控等特點(diǎn)，成為豐富的開發(fā)新藥的潛在資源［1］。聚球藻(Synechococcus)是藍(lán)藻(Cyanobacteria)的一種單細(xì)胞藻類，細(xì)胞呈圓柱形、卵形或橢圓形，廣布于世界各大洋，數(shù)量巨大，特別是在近岸水域數(shù)量豐富，在熱帶和溫帶海洋中的豐度通常在103～105個/mL，是超微型浮游生物中的優(yōu)勢組分［2］。目前，對于聚球藻的研究主要集中在其生長條件、對環(huán)境的影響、分子生物學(xué)等方面［3，4］，我們實(shí)驗室已經(jīng)在聚球藻油脂成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化方面作了深入研究［5］，但是對其胞內(nèi)活性成分的研究尚未見報道。本研究主要通過溶劑提取、柱層析分離等手段從聚球藻中分離活性化合物成分，并跟蹤其生物活性，以便為從海洋微藻中尋找新的抑菌、抗氧化活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

聚球藻(Synechococcus)原種由中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(MACC)提供，經(jīng)進(jìn)一步分離純化后由煙臺大學(xué)海洋生化工程研究所保存。

實(shí)驗儀器:RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;6980GC-5973MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫公司;SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;Agilent 1100型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司;LabTeach UV-1100型紫外分析儀，美國萊伯泰科公司;Bruker AVANCE 400 Digital NMR型核磁共振儀，德國Bruker公司。

1.2 聚球藻有機(jī)溶劑粗提物的制備

通過冷凍干燥收集獲得藻粉83.2 g，對藻粉用95%的乙醇浸提3次，浸提液濃縮后懸浮于水中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，合并各相萃取相并濃縮，獲得三種有機(jī)溶劑粗提物。

1.3 各相粗提物的抑菌活性檢測

采用牛津杯法［6］，受試菌株為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和普通變形桿菌四種細(xì)菌，配制LB培養(yǎng)基，滅菌后在超凈工作臺中倒平板，將四種細(xì)菌接種(1～2接種環(huán))到10 mL無菌水中，制成菌懸液。取0.05 mL菌懸液加入平板中，涂布均勻，在平板上放置牛津杯，并在牛津杯中加入0.15 mL 15 mg/mL的樣品乙醇溶液，以無水乙醇為空白對照，每個菌種做3組平行對照。將培養(yǎng)皿在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小及有無，從而判斷有無抑菌效果及抑菌能力的大小。

1.4 各相粗提物的抗氧化活性檢測

采用Binsan等的方法［7］稍加改進(jìn)。測定方法:1.5 mL的DPPH溶液(0.2 mmol/L無水乙醇配制)加入到1.5 mL的各種樣品的無水乙醇溶液中，劇烈震蕩后，室溫避光反應(yīng)30 min后，以無水乙醇為空白，于517 nm處測定吸光值。平行測定3次。測定結(jié)果以清除率(E)表示，計算公式:

E(%)=［1-(A樣品-A樣品對照)/A對照］×100%

其中，A樣品:1.5 mL DPPH溶液 +1.5 mL樣品溶液的吸光值;A樣品對照:1.5 mL無水乙醇溶液+1.5 mL樣品溶液的吸光值;A對照:1.5 mL DPPH溶液+1.5 mL無水乙醇溶液的吸光值。

1.5 各相粗提物組成成分分析

三種有機(jī)相粗提物組成成分采用GC-MS色譜技術(shù)進(jìn)行分析。

樣品進(jìn)行甲酯化:取出各相粗提物用水懸浮，鹽酸調(diào)pH至3，用正己烷萃取，萃取的有機(jī)相萃取液除去有機(jī)溶劑后做甲酯化。所得樣品置于150 mL量筒中用乙醚/正己烷(2∶1)15 mL溶解，然后加入甲醇15 mL、0.8 mol/L氫氧化鉀溶液15 mL，搖勻后靜置5 min，加蒸餾水至刻度，吸取上層脂肪酸甲酯做GC-MS分析。

GC條件:DB-WAX柱:30 m×0.25 mm×0.25 μm;進(jìn)樣口溫度:230℃ ;進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣;分流比:20∶1;柱流量:0.88 mL/min;柱溫(程序升溫):150℃(保留2 min)→230℃(保留60 min)。

MS條件:離子源溫度:200℃;Interface Temp:230℃;掃描質(zhì)量范圍:40～450 amu。

1.6 聚球藻石油醚相的分離純化

硅膠柱層析分離:以200～300目的硅膠裝填玻璃柱，以石油醚/丙酮(6∶1至100%丙酮)進(jìn)行梯度洗脫，收集餾分Ⅰ～Ⅲ。

凝膠柱進(jìn)一步分離純化:將組分Ⅰ用Sephadex LH-20凝膠柱分離，以氯仿/甲醇1∶1進(jìn)行洗脫，收集餾分，在254 nm下檢測餾分的紫外吸收。

制備型薄層層析:經(jīng)凝膠柱分離后收集的餾分，再經(jīng)薄層層析純化收集，以石油醚/丙酮5∶1為展開劑，獲得單體化合物2.15 mg。

1.7 化合物純度檢測及結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)薄層層析獲得的化合物采用高效液相進(jìn)行純度檢測。HPLC色譜條件:C18柱;檢測波長:205 nm;流速1.0 mL/min，檢測時間30 min;流動相:甲醇∶水 =98∶2。

結(jié)構(gòu)鑒定:樣品用CDCl3溶解后，室溫條件下，在BrukerAVANCE400 DigitalNMR型核磁共振儀上做碳譜和氫譜檢測，與化合物標(biāo)準(zhǔn)庫進(jìn)比對，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 各相粗提物的抗菌活性

各有機(jī)相粗提物的抑菌活性從表1可以看出:石油醚相，乙酸乙酯相和正丁醇相對四種細(xì)菌均有一定的抑制作用，其中石油醚相抑菌效果較明顯，乙酸乙酯相和正丁醇相抑菌作用相當(dāng)，水相對細(xì)菌沒有抑菌活性，這與江紅霞等的文獻(xiàn)報道［8］相符，即微藻中水溶性提取物基本沒有抑菌活性。

表1 有機(jī)相粗提物的抑菌活性Table 1 The antibacterial activity of organic phase crude extracts

注:1)-無抑菌圈，+7.1-9.0 mm，++9.1-11.0 mm，+++11.1-13.0 mm，++++13.1-15.0 mm;2)B.s枯草芽孢桿菌，S.a金黃色葡萄球菌，E.c大腸桿菌，P.v普通變形桿菌。Note:1)– no bacterial colony grows，+7.1-9.0 mm，++9.1-11.0 mm，+++11.1-13.0 mm，++++13.1-15.0 mm;2)B.s bacillus subtilis，S.a staphylococcus aureus，E.c escherichia coli，P.v Proteus vulgaris.

2.2 各相粗提物的抗氧化活性

由圖1可看出，各相自由基清除率大小對濃度有一定依賴關(guān)系，濃度越大，清除率越高，石油醚相的自由基清除率較好，在相同樣品濃度下，石油醚相的自由基清除率明顯高于乙酸乙酯相和正丁醇相，當(dāng)樣品濃度為150 μg/mL時，石油醚相的自由基清除率遠(yuǎn)大于另外兩相，且三相溶劑的極性大小為石油醚＜乙酸乙酯＜正丁醇，三相相比，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性物質(zhì)主要集中在低極性組分。水相沒有抗氧化活性，乙酸乙酯相和正丁醇相的自由基清除效果相近，當(dāng)濃度為200 μg/mL時，乙醇粗提物的自由基清除率大于50%。

圖1 各有機(jī)相粗提物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of the organic phase crude extractings

2.3 各有機(jī)相粗提物的GC-MS分析

由圖2和表2可以看出，石油醚相萃取物用GC-MS聯(lián)用技術(shù)共鑒定出20種成分，包括13種酸類，2種碳烯，2種丁酯，1個烷醇，1個葉綠醇和1個三十四烷。，其中酸類物質(zhì)含量最多，占69.93%;其次是酯類，占12.86%;碳烯類，占11.3%;醇類占的量較少，為5.91%。其中百分含量較多的成分有軟脂酸，占總百分含量的33%;反式9-十六碳烯酸，占總百分含量的12.87%;鄰苯二甲酸二丁酯，占總百分含量的12%。可見，石油醚相較好的抗菌和抗氧化活性物質(zhì)主要為酯類化合物。

由圖3和表3可以看出，正丁醇萃取物用GCMS聯(lián)用技術(shù)共鑒定出20種成分，包括酸類、烷烴類、酯類、酮類和醇類，共占總百分含量的98.25%。其中含量最多的是酯類，達(dá)到40.5%;其次是醇類，為27.61%;酸類，占15.03%;烷烴類，占8.08%;酮類，占7.03%。百分含量在10%以上的有4種成分，分別為4-羥基-丁酸、甘油、鄰苯二甲酸二乙酯和鄰苯二甲酸二丁酯。

結(jié)果表明，石油醚組分中活性物質(zhì)含量較多，且活性較好，乙酸乙酯相含量較少，但抗菌抗氧化活性和正丁醇相萃取物相當(dāng)。由于乙酸乙酯相量較少，且其中組分大部分不可汽化，導(dǎo)致GC-MS分析所得數(shù)據(jù)較少，有待于進(jìn)一步的研究。以下主要針對石油醚相進(jìn)行分離純化。

圖2 石油醚相的GC-MS圖譜Fig.2 The GC-MS map of the extracts in the petroleum ether phase

表2 石油醚相的GC-MS分析結(jié)果Table 2 The analysis results of The GC-MS map of the extracts in the petroleum ether phase

7 8.333 三十四烷Tetratriacontane 0.89 8 8.609 軟脂酸甲酯Hexadecanoic acid，methyl ester 33 9 8.909 反式9-十六碳烯酸甲酯9-Hexadecenoic acid，methyl ester)- 12.84 10 9.631 十七酸甲酯Heptadecanoic acid，methyl ester 1.29 11 9.887 反式9-十八碳烯酸甲酯9-Octadecenoic acid(Z)-，methyl ester 2.38 12 10.65 十八烷酸甲酯Octadecanoic acid，methyl ester 0.49 13 10.905 8-十八碳烯酸甲酯8-Octadecenoic acid，methyl ester 7.19 14 11.459 9，12-亞油酸甲酯 9，12-Octadecadienoic acid(Z，Z)-，methyl ester 5.04 15 11.858 8-壬炔酸8-Nonynoic acid 0.68 16 12.106 鄰苯二甲酸二異丁酯1，2-Benzenedicarboxylic acid，bis(2-methylpropyl)ester 0.86 17 12.298 亞麻酸甲酯 9，12，15-Octadecatrienoic acid，methyl ester，(Z，Z，Z)- 1.18 18 12.889 葉綠醇Phytol 5.45 19 14.367 鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate 12 20 16.817 順式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸甲酯 Methyl eicosa-5，8，11，14，17-pentaenoate 2.01

圖3 正丁醇相的GC-MS圖譜Fig.3 The GC-MS map of the extracts in the butanol phase

表3 正丁醇相的GC-MS分析結(jié)果Table 3 The analysis results of The GC-MS map of the extracts in the butanol phase

13 9.611 異丁基棕櫚酸酯Hexadecanoic acid 2-methylpropyl ester 0.84 14 9.718 鄰苯二甲酸二乙酯Diethyl Phthalate 13.61 15 11.103 二己烯丁酸酯 Butanoic acid，2-hexenyl ester，(E)- 0.57 16 11.758 1，2-苯二甲酸二(異丁基)酯 1，2-Benzenedicarboxylic acid，bis(2-methylpropyl)ester 9.79 17 11.983 順式-1-異丙基-1，2-環(huán)己烷二醇 1，2-Cyclohexanediol，1-(1-methylethyl)-，cis- 1.75 18 12.234 1-十五烷醇1-Pentadecanol 0.23 19 12.408 環(huán)戊烷甲酸癸基酯 Cyclopentanecarboxylic acid，decyl ester 0.34 20 14.096 鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate 12.09

2.4 石油醚相化合物的分離純化

石油醚相經(jīng)硅膠柱層析洗脫后在254 nm下測定吸光度得到峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ三個組分(圖4)。合并1～5管，15～20管，52～55管吹干備用，峰Ⅰ經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱繼續(xù)分離。峰Ⅰ經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離后在254 nm下測吸光度得到Ⅰ-Ⅰ和Ⅰ-Ⅱ兩個峰(圖5)，峰Ⅰ-Ⅰ經(jīng)制備薄層層析石油醚∶丙酮5∶1純化收集得單體化合物Ⅰ。

2.5 化合物Ⅰ純度鑒定和結(jié)構(gòu)分析

化合物Ⅰ經(jīng)高效液相檢測后純度較好，進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析后，其核磁共振結(jié)果如下:1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ(ppm):5.35(1H，t，J=5.2 Hz，H-6)，3.53(1H，m，H-3)。13C NMR(400 MHz，CDCl3)，37.22(C-1)，31.88(C-2)，71.78(C-3)，42.27(C-4)，140.73(C-5)，121.70(C-6)，31.87(C-7)，31.63(C-8)，50.08(C-9)，36.48(C-10)，21.06(C-11)，39.73(C-12)，42.27(C-13)，56.06(C-14)，24.28(C-15)，28.23(C-16)，56.73(C-17)，11.84(C-18)，19.38(C-19)，35.77(C-20)，19.00(C-21)，33.90(C-22)，28.23(C-23)，45.78(C-24)，29.09(C-25)，19.82(C-26)，18.76(C-27)，23.02(C-28)，11.96(C-29)。無色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)142～148℃，分子式C29H50O。以上數(shù)據(jù)經(jīng)與文獻(xiàn)［9，10］對比，確定該化合物為β-谷甾醇。

β-谷甾醇是一種植物固醇，近年來發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇對腫瘤有防治作用，其可以通過抑制腫瘤細(xì)胞和基底膜的粘附及細(xì)胞侵入基底膜而阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［11］，除此之外，β-谷甾醇還有降低血清膽固醇的作用，對于治療Ⅱ型高血脂癥及預(yù)防動脈粥樣硬化有較好的效果。

3 結(jié)論

3.1 聚球藻石油醚、正丁醇及乙酸乙酯相提取物均有一定的抗菌和抗氧化活性，其中石油醚相和正丁醇相的活性較好，水相沒有抗菌和抗氧化活性。

3.2 石油醚組分中活性物質(zhì)含量較多，且活性較好，乙酸乙酯相含量較少，但抗菌抗氧化活性和正丁醇相萃取物相當(dāng)，由此可見，聚球藻中的抗菌抗氧化活性物質(zhì)主要集中在低極性組分，乙酸乙酯相和正丁醇相中的活性物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

3.3 從石油醚相中分離獲得一單體化合物，經(jīng)核磁分析確定為β-谷甾醇。

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