桑黃等十種食藥用菌抗氧化和延緩衰老功效的比較研究

汪雯翰，張勁松，楊 焱，嚴夢秋，吳 迪，吳 娜，章 慧

國家食用菌工程技術研究中心農業部應用真菌資源與利用重點開發實驗室上海市農業遺傳育種重點開發實驗室上海市農業科學院食用菌研究所，上海 201403

食用菌是指一類可供人們食用的大型真菌，具有肉質、膠質或纖維質的子實體，我們俗稱為“菇”、“蕈”、“菌”、“耳”，例如香菇、黑木耳、銀耳、榆耳和雙孢蘑菇等距今7000年前的河姆渡文化已有人類將食用菌作為食物的記錄，而在2000多年前的《神農本草經》中則具有關于赤芝、紫芝、黑芝、白芝、茯苓和木耳等多種食用菌藥效學的文字記錄，其中關于靈芝的記載為“益心氣、解胸中結、補中、增智慧、不忘，延年神仙等”，因而食用菌除具有口味鮮美和肉質細嫩等優點以外，還具有一定的醫療保健功能。

隨著生活水平的不斷提高，保健食品開發已逐漸成為食品開發的潮流和發展方向，具有良好的前景和廣大的市場潛力，食用菌因具有食用性和保健性，是功能食品開發的優良原料。國內外已有大量關于食藥用菌抗氧化活性的文獻報道，然而此類文章主要集中于報道單一品種的抗氧化活性研究，缺乏對多種食用菌提取物同時在抗氧化和延緩衰老等多種模型上藥效學的比較研究［1-3］。本實驗采用清除自由基模型、細胞抗氧化和延緩衰老模型從桑黃等十種常見的食藥菌醇提物中篩選出抗氧化延緩衰老活性強的品種，為后續的食用菌功能食品開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 食用菌原料

桑黃(銹革孔菌科、木層孔菌屬，Phellinus baumii Pliát)子實體由上海市農業科學院食用菌研究所在2010年栽培獲得，菌種保存于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心，標本存放于上海市農業科學院食用菌研究所加工技術與發酵工程研究室;樺褐孔菌(銹革孔菌科、纖孔菌屬，Inonotus obliquus(Pers.:Fr.)Pilát)，于 2009 年購自于黑龍江哈爾濱市關東天然物產商社;靈芝(靈芝科、靈芝屬 Ganoderma lingzhi Sheng H.Wu，Y.Cao ＆ Y.C.Dai)，子實體由上海市農業科學院食用菌研究所在2009年栽培獲得，菌種保存于保存于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心，標本存放于上海市農業科學院食用菌研究所加工技術與發酵工程研究室;香菇(小皮傘科、微香菇屬 Lentinula edodes(Berk.)Pegler);杏鮑菇(側耳科、側耳屬，Pleurotus eryngii(DC.)Quél.);雞腿菇(傘菌科、鬼傘屬，Coprinus comatus(O.F.Müll.)Pers.);灰樹花(薄孔菌科、灰樹花屬 Grifola frondosa(Dicks.:Fr.)Gray);猴頭(猴頭菌科、猴頭菌屬，Hericium erinaceus(Bull.:Fr.)Pers.);姬松茸(傘菌科、蘑菇屬，Agaricus blazei Murrill);蛹蟲草(蟲草菌科、蟲草菌屬，Cordyceps militaris(Fr.)Link)，以上子實體均于2011年購自上海百信生物科技有限公司;以上10種食藥用菌均經廣東省微生物研究所李泰輝研究員鑒定為各自的子實體。

1.1.2 試劑

Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養基(#946880)、RPMI-1640(#1016442)、胎牛血清(#8172881)、馬血清(#1021372)和胰酶(含0.25%EDTA)(#1128331)購自GIBCO公司;疊氮鈉(Sodium azide，NaN3)(#20030401)和二甲亞砜［Dimethyl sulfoxide，DMSO(#RNBB8137)］購自 Sigma公司;鏈霉素(#3061B12)、青霉素(#0610S02)和3-(4，5-dimethylthiozol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)(#11088866001)購自AMERSCO公司;30%H2O2(#20061130)購自國藥集團。

1.1.3 儀器

DJ-10A中藥粉碎機(上海隆拓儀器設備有限公司);BC-R2001型旋轉蒸發儀(上海貝凱生物化工設備有限公司);Heto PL-3000冷凍干燥機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);Synergy HT多功能酶標儀(美國BIO2TEK公司);Delta series生物安全柜(美國LABCONCO公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇提取物的制備

分別取干燥的十種食用菌子實體粉末30 g，依次加入10倍體積95%乙醇，25℃浸泡24 h，過濾，殘渣重復上述操作一次，合并兩次濾液，濃縮揮去乙醇后，冷凍干燥，即得。

1.2.2 抗氧化實驗

1.2.2.1 清除超氧陰離子試驗

上述乙醇提取物分別用DMSO配制成不同濃度(200、500 和2000 μg/mL)的溶液，改進郭藹光［5］的方法測定對超氧陰離子的清除率。分別取10 μL加入96孔板(空白對照為DMSO，陽性對照為樣品相同濃度的Vc溶液)，由泵1泵入10 μL 6.25×10-4mol/L鄰苯三酚溶液，泵2泵入150 μL魯米諾-CBS溶液(pH 10.2)，在20℃啟動發光反應，每0.6 s記錄一次發光值，連續記錄30 s。超氧陰離子清除率按公式(1)計算:

公式(1):

1.2.2.2 清除H2O2自由基試驗

乙醇提取物分別用DMSO配制成不同濃度(200、500 和 2000 μg/mL)的溶液，改進 Toshimasa Toyo’oka等［6］方法測定乙醇提取物對H2O2的清除率。分別取5 μL樣品加入96孔板(空白對照為DMSO，陽性對照為樣品相同濃度的Vc溶液)，由泵1泵入150 μL魯米諾-CBS溶液(pH 9.5)，泵2泵入10 μL 6%H2O2，在20℃啟動發光反應，每0.6 s記錄一次發光值，連續記錄30 s，H2O2自由基清除率按公式(1)計算。

1.2.3 細胞實驗

1.2.3.1 細胞培養

PC12(腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)于2009年在中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心購買。PC12細胞培養液為DMEM，內含25 mL/L胎牛血清和150 mL/L馬血清，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL;細胞培養于37℃ 5%CO2的培養箱中，細胞匯集至85%時進行傳代接種，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3.2 體外PC12細胞氧化損傷試驗

參照胡金霞［7］實驗方法，并略作改動。取對數生長期的PC12細胞，用DMEM培養基稀釋至2×104個/mL。取190 μL細胞懸液接于96孔板中，然后分別加入10 μL 0.25 mmol H2O2刺激4 h。用DMEM培養基將樣品稀釋到不同濃度的樣品溶液(2、10和40 mg/mL)將全部培養基吸出后加入199 μL新鮮培養基和1 μL不同濃度樣品，每個樣品重復3孔，于5%CO2和37℃細胞培養箱中培養48 h后。每孔加MTT 20 μL，繼續培養4 h，離心(2000 rpm，5 min)，棄上清，每孔加 DMSO 150 mL，震蕩10 min，用酶標儀測570 nm的OD值，試驗重復3次。

1.2.3.3 體外PC12細胞抗衰老試驗

根據前期實驗結果選用25 mmol/L的NaN3處理PC12 4h作為誘導細胞衰老的方式。用胰酶將對數生長期的PC12細胞消化，用DMEM培養基將細胞稀釋為5×104個/mL，每孔190 μL接種于96孔板，細胞貼壁后，加入1 mol/L的NaN3處理液10 μL，處理24 h，用DMEM培養基將樣品稀釋到不同濃度的樣品溶液(2、10和40 mg/mL，吸出培養基，每孔加入含有血清的DMEM培養液199 μL，然后加入1 μL不同濃度的樣品，置于37℃、5%CO2培養48 h后，按1.2.3.2MTT試驗方法檢測細胞存活率。

1.2.4 數據統計

以SPSS 13.0軟件包對所獲得實驗數據進行統計學分析，數據表示為平均數±標準差，結果差異的顯著性檢驗通過ANOVA方差檢驗完成，顯著性設定為*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

2 結果與分析

2.1 清除超氧陰離子試驗結果

圖1表明，200 mg/mL桑黃、樺褐孔菌和靈芝醇提物清除超氧陰離子的能力［96.11% ±0.30%、75.92% ±0.77%和65.60% ±6.66%(表1)］分別位于前三位，而杏鮑菇、姬松茸、灰樹花和蛹蟲草醇提物［42.23% ±3.06%、34.81% ±1.12%、40.16% ±2.70%和40.63% ±0.61%(表1)］的清除超氧陰離子能力較為相近，其余的食用菌(猴頭，6.24% ±2.05%;香菇，14.36% ±2.34%;雞腿菇，7.92% ±3.19%)則較弱或沒有。

圖1 十種食用菌醇提物對超氧陰離子的清除率Fig.1 Superoxide anion scavenging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi

2.2 清除過氧化氫試驗結果

圖2表明，2000 μg/mL桑黃、樺褐孔菌和靈芝均具有較強的清除過氧化氫能力［99.31% ±0.03%、97.51% ±0.05%和71.01% ±0.79%(表1)］，并且桑黃的清除效果最好，而雞腿菇、灰樹花和蛹蟲草醇提物［53.39% ±5.05%、39.17% ±1.84%和48.61% ±2.23%(表2)］的清除過氧化氫能力較為相近，其余的食用菌(猴頭，29.82% ±5.68%;香菇，32.51% ±7.80%;姬松茸，21.49% ±0.99%;杏鮑菇，21.15% ±7.26%)則較弱或沒有。

2.3 體外PC12細胞氧化損傷試驗結果

試驗結果表明在十種食用菌中，與非細胞水平抗氧化結果相似，200 μg/mL桑黃、樺褐孔菌和靈芝的醇提物對PC12細胞損傷有良好的保護作用(0.868±0.078、0.270±0.004和0.261% ±0.013%)

圖2 十種食用菌醇提物對H2O2的清除率Fig.2 H2O2scavenging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi

表1 十種食用菌醇提物對超氧陰離子和過氧化氫的清除率Table 1 Superoxide anion and H2O2scavenging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi

(表2)，其中桑黃的效果最好，而其它食用菌醇提物(杏鮑菇，0.198 ±0.005;雞腿菇，0.206 ±0.017;姬松茸，0.185±0.003;香菇，0.190±0.010;灰樹花，0.201±0.011;蛹蟲草，0.185±0.002;猴頭，0.186±0.001)無明顯效果(圖3)。

圖3 十種食用菌醇提物對PC12細胞的氧化損傷保護作用Fig.3 Antioxidant activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi on PC12

2.4 體外PC12細胞抗衰老試驗結果

本試驗結果表明，在此模型中200 μg/mL桑黃與以上試驗結果相同，具有最好的抗細胞衰老效果(1.419 ±0.070)(表2)，而 200 μg/mL 樺褐孔菌和靈芝的功效較為相近(0.693±0.036和0.701±0.031)(表2)，這與H2O2損傷的細胞學實驗結果相似，而與非細胞水平抗氧化實驗結果有所不同(圖4)。

圖4 十種食用菌醇提物對NaN3誘導PC12細胞衰老的修復作用Fig.4 Anti-aging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi on PC12

表2 十種食用菌醇提物對PC12細胞氧化損傷和衰老的修復作用Table 2 Antioxidant and anti-aging activities of ethanol extracts of ten edible/medicinal fungi on PC12

損傷組 Injury group 0．183 ±0．001 0．326 ±0．004杏鮑菇Pleurotus eryngii 10 0．190 ±0．004 0．316 ±0．004 50 0．191 ±0．002 0．318 ±0．004 200 0．198 ±0．005 0．323 ±0．010雞腿菇Coprinus comatus 200 0．183 ±0．002 0．423 ±0．028 500 0．188 ±0．003 0．515 ±0．062 2000 0．206 ±0．017 0．701 ±0．031姬松茸Agaricus blazei 200 0．182 ±0．005 0．254 ±0．002 500 0．185 ±0．002 0．337 ±0．005 2000 0．185 ±0．003 0．392 ±0．021香菇Lentinula edodes 200 0．181 ±0．003 0．334 ±0．013 500 0．187 ±0．006 0．340 ±0．006 2000 0．190 ±0．010 0．359 ±0．008樺褐孔菌Inonotus obliquus 200 0．187 ±0．001 0．433 ±0．017 500 0．196 ±0．003 0．471 ±0．024 2000 0．270 ±0．004 0．693 ±0．036桑黃Phellinus baumii 200 0．206 ±0．006 0．935 ±0．093 500 0．366 ±0．007 1．241 ±0．036 2000 0．868 ±0．078 1．419 ±0．070靈芝Ganoderma lingzhi 200 0．195 ±0．002 0．423 ±0．028 500 0．194 ±0．001 0．515 ±0．062 2000 0．261 ±0．013 0．701 ±0．031灰樹花Grifola frondosa 200 0．193 ±0．002 0．325 ±0．002 500 0．198 ±0．002 0．329 ±0．003 2000 0．201 ±0．011 0．335 ±0．009蛹蟲草Cordyceps militaris 200 0．180 ±0．002 0．324 ±0．009 500 0．183 ±0．004 0．334 ±0．002 2000 0．185 ±0．002 0．369 ±0．007猴頭Hericium erinaceus 200 0.186±0.002 0.285±0.023 500 0.188±0.001 0.398±0.033 2000 0.186±0.001 0.409±0.023

2.5 小結

桑黃、樺褐孔菌和靈芝三種食藥用菌對超氧陰離子和過氧化氫自由基表現出良好的清除效果，并且對PC12細胞的氧化損傷具有較好的修復作用，說明這三種食藥用菌在非細胞水平和細胞水平上均有良好的抗氧化能力。同時，對十種食藥用菌的抗細胞衰老能力實驗結果表明，這三種食藥用菌的抗衰老能力明顯好于其他幾種食藥用菌。以上研究結果提示桑黃、樺褐孔菌和靈芝具有良好的抗氧化和延緩衰老的雙重功效。

3 討論

衰老(aging，senescence)又稱老化，通常是指在正常狀況下生物發育成熟后，隨年齡增加，自身機能減退，內環境穩定能力與應激能力下降，結構、組分逐步退行性變，趨向死亡的不可逆轉的現象。近年來，隨著現代遺傳學、分子生物學、細胞生物學和分子免疫學等邊緣學科的飛速發展，人們對衰老的機制有了深層次的認識，并在大量實驗證據的基礎上提出了許多新的學說，分別從不同的角度探討了衰老發生的機制和對策。在這些衰老學說中，以自由基學說最受重視，支持這一理論的實驗證據也最為豐富。機體較弱的抗氧化能力，會導致組成體內細胞受到自由基的攻擊，從而引起細胞損傷，并導致機體快速衰老。利用疊氮鈉誘導的PC12細胞模型可在細胞水平評價待測物質的抗衰老能力。本研究以自由基學說作為研究基礎，從食用菌中尋找具有抗氧化活性的品種，并利用PC12細胞衰老模型進行驗證。在本實驗中，桑黃、樺褐孔菌和靈芝均表現出一定的抗氧化能力，但桑黃的效果在兩項試驗中均要好于后兩種食用菌，并且在高濃度(2000 μg/mL)接近VC陽性對照清除效果。桑黃在抗細胞衰老試驗中也表現出最好的抗衰老效果。

在前期的實驗中，我們比較了桑黃水提物和醇提物在非細胞和細胞水平上抗氧化和抗衰老效果，實驗結果提示，醇提物的活性明顯高于水提物。進一步通過正丁醇萃取獲得的萃取相其抗衰老活性得到了明顯提高，這一結果表明桑黃子實體中起到抗氧化和抗衰老活性的主要是小分子化合物［8］。桑黃子實體小分子主要為黃酮及其衍生物、香豆素類、角醇類等，莫順燕等首次從桑黃中分離得到5個黃酮和2個香豆素類化合物，分別為袖皮素、櫻花亭、二氫莰非素、7-甲氧基二氫茨非素、北美圣草素、香豆素及蓖若亭，后來又分離得到個新的二氫黃酮衍生物，分別為5，7，4'-三經基鄰羥芐基二氫黃酮和5，7，4'-三羥基-6-鄰羥芐基二氫黃酮［9］。已有研究表明黃酮類、香豆類和角醇類化合物均具有一定的抗氧化和抗衰老效果，因而在后續的研究中需要通過分離純化的方法從桑黃醇提物中獲得單一化合物，通過藥理學實驗尋找有效物質，并闡明其作用機理。

目前國內市場上食用菌的功能食品主要集中于提高免疫力的多糖類保健品，除了靈芝三萜類產品以外，對食用菌小分子產品的開發基本還處于空白領域。衰老是所有人都無法避免的正常生理現象，隨著人們對自身健康的不斷關注，為延緩衰老功能食品的開發提供了廣闊的市場前景。本研究的對象為市場上最為常見的10種食藥用真菌，從中篩選出具有抗良好氧化和抗衰老功效的桑黃對功能食品開發具有一定的指導意義。

1 Fu L，Chen H，Dong P，et al．Effects of ultrasonic treatment on the physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from mushroom Inonotus obliquus.J Food Sci，2010，75:C322-337.

2 Aydin S，Aytac E，Uzun H，et al．Effects of Ganoderma lucidum on obstructive jaundice-induced oxidative stress.Asian J Surg，2010，33:173-180.

3 Yang Y，Hu J，Liu Y，et al．Antioxidant and cytotoxic activities of ethanolic extracts and isolated fractions of species of the genus Phellinus Quél.(Aphyllophoromycetideae).Int J Med Mushrooms，2011，13:145-152.

4 Guo AG(郭藹光)，Wang ZY(王振鎰).Antioxidation of pyrogallol-chemiluminescence assay for superoxide dismutase activity.J Plant Physiol(植物生理學通報)，1989，3:54-57.

5 Toyo'oka T，Kashiwazaki T，Kato M.On-line screening methods for antioxidants scavenging superoxide anion radical and hydrogen peroxide by liquid chromatography with indirect chemiluminescence detection.Talanta，2003，60:467-475.

6 Hu JX(胡金霞)，Yang Y(楊焱)，Zhang JS(張勁松)，et al．The antioxidant activity of ethanol extracts from Phellinus baumii and their protective effects against oxidative damage of nerve cell.Acta Agric Shanghai(上海農業學報)，2009，25:58-61.

7 Yun C，Wu SH，Dai YC．Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”.Fungal Diversity，2012，56(1):49-62.

8 Wang WH(汪雯翰)，Wang QB(王欽博)，Zhang JS(張勁松)，et al．Protective effects of lipophilic extracts of Phellinus baumii on PC12 aging model.Mycosystema(菌物學報)，2011，30:760-766.

9 Mo SY(莫順燕)，Yang YC(楊永春)，Shi JG(石建功)．Studies on chemical constitutes of Phellinus igniarius.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2003，28:339-341.