HPLC法檢測苦杏仁苷及其酶解產物

常 軍

江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013

苦杏仁苷(Amygdalin)，屬苯乙醇腈的β-龍膽二糖苷，是苦杏仁中的主要有效成分之一，其結構見圖1。苦杏仁苷廣泛存在于杏、桃、李等多種薔薇科植物果實的種子中［1］，具有良好的抗腫瘤［2］、抗氧化作用［3］、調節免疫功能的作用［4］及鎮咳平喘的作用［5］。目前對苦杏仁苷的研究主要集中在分離純化［6］、含量檢測［7］及代謝［8］及抗腫瘤藥理［9］研究。本課題組在苦杏仁苷在催化轉化研究中發現，苦杏仁苷在黑曲酶胞外全酶制劑的催化下，4 h內全部降解，生成4個產物，分別為杏仁腈、野櫻苷、苯甲醛及一個新的化合物phenyl-(3，4，5-trihydroxy-6-methyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-acetonitrile(PTMT)，是野櫻花苷的6位羥基取代衍生物。苦杏仁苷及其降解產物的結構如圖1。本文建立了一個快速、準確的HPLC同時檢測苦杏仁苷及其4個產物的方法。

圖1 苦杏仁苷及其酶解產物結構圖Fig.1 Chemical structures of amygdalin and its meabolites

1 材料與方法

1.1 材料

催化降解用苦杏仁苷從苦杏仁中分離純化得到，純度達到85%;苦杏仁苷、杏仁腈、苯由酸、野櫻苷標準品均購自sigma公司，純度98%以上;PTMT從苦杏仁苷的酶解產物中分離、純化得到，純度98%［10］。甲醇(Fisher)為色譜純試劑，其它的均為分析純試劑。

1.2 標準溶液的制備

精密稱取苦杏仁苷、杏仁腈、苯由酸、野櫻苷及PTMT各20 mg溶于10 mL去色譜純甲醇中、定容得到濃度為2 mg/mL的標準溶液母液。制作標準曲線時，取25、125、250、500、750、1000 μL 母液于5 mL容量瓶中定容得到濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 及 1 mg/mL 的各標準品測試溶液，4℃冰箱中貯藏備用。

1.3 HPLC檢測方法

安捷倫液相色譜系統，迪馬C18ODS柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫箱控制在25℃，流動相30%甲醇溶液，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量 10 μL。

1.4 線性關系

應用“1.3”中 HPLC 方法分析 0.01、0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL 的各標準品，以質量(μg)為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得到回歸方程。

1.5 不同溫度條件下穩定性的測定

分別取濃度為0.2 mg/mL的各標準溶液5 mL置于10 mL試管中，分別置于30、40、50保溫12 h，每2 h取樣一次進行分析。

1.6 不同pH條件下穩定性的測定

取5支10 mL試管，各裝去離子水5 mL，并用1 mol/L 的 HCl調節 pH 值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，用移液管吸取1 mL 0.2 mg/mL各標準溶液，移入上述各試管中，25℃保溫12 h，每2 h取樣一次進行分析。

1.7 精密度和準確度測定

取濃度 0.1、0.4、0.8 mg/mL 的樣品各2 mL，分別于同一天和隔天的采用“1.3”的HPLC方法進行檢測含量，每個樣品重復6次，分別計算天內和隔天的RSD和RE值。

1.8 回收率測定

黑曲霉總酶制備將黑曲霉斜面菌種接入4 L培養基(8 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，5 g/L KH2PO4，5 g/L NaCl，1 g/L MgSO4·7H2O，1 g/L MnSO4·4H2O，pH 6.5)中，28℃培養5 d。發酵液用飽和(NH4)2SO4沉淀12 h后，再在4℃條件下鹽析12 h，隨后冷凍干燥得黑曲霉總酶。

82 U/mL的總酶溶液配制 稱取黑曲霉總酶凍干粉40.3 mg，溶于10 mL水溶液中得酶溶液，得82 U/mL的黑曲霉總酶溶液。

用移液器準確移取準確移取5 mL上述黑曲霉總酶溶液，加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液鈍化酶，0.1、0.5、1 mL濃度為l mg/mL各標準溶液到1 mL上述鈍化酶溶液，按照“1.3”中的方法檢測各成分含量，每個樣品重復3次。

2 結果與討論

2.1 HPLC分析方法

從圖2中可看出，苦杏仁苷及其4外酶解產物色譜形為良好，樣品中的雜質沒有對峰的分辨率產生干擾，苦杏仁苷、PTMT、野櫻花苷、苯甲醛和杏仁腈的保留時間分別為 5.087、13.836、16.357、22.775和3.307 min，樣品與標準品中的相應峰保留時間一致。

圖2 苦杏仁苷及其酶解產物的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of amygdalin and its metabolites

2.2 線性關系

苦杏仁苷、PTMT、野櫻花苷、苯甲醛和杏仁腈的線性回歸方程分別為:Y=8．94×105+3．76×103X(R=0．9998)，Y=4．54 × 106-2．84 × 104X(R=0.9997)，Y = 6．75 × 105-7．73 × 103X(R=0.9998)，Y =8．31 × 104+5．22 × 103X(R=0.9998)，Y = 7．19 × 105-4．38 × 103X(R=0.9996)。苦杏仁苷的線性范圍為0.05～0.44 μg，PTMT的線性范圍為0.043～0.51 μg，野櫻花苷的線性范圍為0.05～0.54 μg，苯甲醛的線性范圍為0.06～0.48 μg，杏仁腈的線性范圍為0.05～0.52 μg。從各回歸方程的R值可以看出，各化合物在此HPLC條件下線性回歸良好，滿足要求。

2.3 不同溫度條件下穩定性

結果表明，溫度低于40℃時，苦杏仁苷、PTMT、野櫻花苷、苯甲醛和杏仁腈12 h后的峰面積RSD值均分別為0.8%、1.1%、1.2%、1.1%、0.9%。當在50℃保溫時，苦杏仁苷在6 h時的RSD值為4.5%，杏仁腈的RSD值為3.7%，這表明苦杏仁苷和杏仁腈在此溫度下不穩定。50℃保溫12 h時PTMT、野櫻花苷、苯甲醛的RSD值分別為1.2%、1.3%和1.1%，這說明PTMT、野櫻花苷、苯甲醛在50℃時穩定。因此，同時測試苦杏仁苷及其酶解產物的溫度不應超過30℃。

2.4 不同pH條件下的穩定性

實驗結果表明，當pH值為5.0時，苦杏仁苷和杏仁腈在溶液中不穩定，4 h時峰面積的RSD值分別為8.7%和7.4%。當pH為6.0時，各成分在溶液中穩定，12 h時苦杏仁苷、PTMT、野櫻花苷、苯甲醛和杏仁腈峰面積的RSD值分別為1.1%、1.2%、1.4% 、0.93% 、1.3% 。

2.5 精密度和準確度

表1為日間和日內的精密度和準確度測試結果，從表中可以看出，所有樣品的日內RSD值低于5.3%，日間RSD值低于4.9，日內的RE值介于0.3～3.3%，日間的RE值介于0.7～4.1%。以上結果表明，該HPLC方法具有較好的精密度和準確度。

表1 日間和日內的精密度和準確度n=6Table 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy(n=6)(mg/mL)

2.6 回收率結果

回收率分析結果表明，苦杏仁苷、PTMT、野櫻花苷、苯甲醛和杏仁腈的回收率分別為99%、100.4%、98%、99%、99%。這表明，所采用HPLC方法回收率符合要求。

3 結論

對苦杏仁苷的研究主要集中在苦杏仁苷的脫毒、加工、分析、檢測等方面［11，12］，尚沒有關于對苦杏仁苷及其酶解產物的分析檢測的研究報道。本文建立了一個高效、快速的同時檢測苦杏仁苷及其4個酶解產物的HPLC方法，應用該方法，可以在23 min內完成一次檢測分析。該HPLC分析方法穩定、可靠，精密度和準確度符合要求，結果能很好的重現，柱溫25℃，pH 6.0～7.0。

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