HPLC法測(cè)定卷柏及其炮制品中穗花杉雙黃酮的含量

吳彩霞，楊宇婷，康文藝*

1河南大學(xué)中藥研究所，開封 475004;2河南省疾病控制中心，鄭州 450003

卷柏為蕨類植物門卷柏科Selaginellaceae卷柏屬植物，約有700種，廣泛分布于全世界。我國(guó)約有50種，分布全國(guó)各地，主產(chǎn)于湖南、福建、四川、陜西、江西、浙江等地。春秋兩季采挖，以春季采挖者為最佳［1］。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載了卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或墊狀卷柏 S．puluinata(Hook.et Gret.)Spring全草入藥［2］。卷柏始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品性味辛、平。具有活血通經(jīng)之功效。用于經(jīng)閉痛經(jīng)、瘤瘦痞塊、跌打損傷等癥。卷柏炭能化瘀止血，用于吐血、崩漏、便血、脫肛等癥。近年來對(duì)卷柏的化學(xué)成分，藥效等進(jìn)行了大量的研究。卷柏的主要化學(xué)成分:黃酮類如:芹菜素、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等;酚類;生物堿;有機(jī)酸等。卷柏的藥理作用主要有:增強(qiáng)免疫和抗腫瘤;縮短凝血時(shí)間升高血小板;抗菌抗炎;鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等［3-6］。

近年來，卷柏炮制方面的文獻(xiàn)報(bào)道主要針對(duì)炮制前后卷柏的化學(xué)成分和藥理作用的變化，未見對(duì)炮制前后卷柏中穗花杉雙黃酮的含量變化的研究。本課題組對(duì)卷柏進(jìn)行了持續(xù)的研究［7-9］，在此基礎(chǔ)上，首次采用HPLC法對(duì)卷柏生品、焦卷柏和卷柏炭中穗花杉雙黃酮的含量進(jìn)行檢測(cè)和分析，探討炮制對(duì)卷柏中穗花杉雙黃酮含量的影響，為科學(xué)、合理的使用該類藥材提供依據(jù)。

1 儀器與材料

島津液相色譜儀 LC-2010CHT，自動(dòng)進(jìn)樣器，Class-VP工作站，四元低壓梯度泵，SPD-10AVP紫外-可見檢測(cè)器;KQ3200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

穗花杉雙黃酮對(duì)照品(自制，純度＞98%);甲醇為色譜純，水、磷酸為分析純;卷柏于2007年7月采集于貴州都勻，經(jīng)河南大學(xué)中藥研究所生藥教研室李昌勤副教授鑒定為卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring的干燥全草。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥材的炮制［9-12］

卷柏生品:取卷柏揀去雜質(zhì)，除去殘根，清水洗凈，切段，陰干;焦卷柏:取凈卷柏段500 g，置鍋內(nèi)用溫火加熱炒至焦黃色，取出，放涼;卷柏炭:取凈卷柏段500 g，置鍋內(nèi)用中火加熱炒至焦黑色，取出，放涼。

2.2 色譜條件

色譜柱Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1% 磷酸水(65∶35);流速:0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):337 nm;柱溫:25℃。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，加少量甲醇溶解，置于25 mL容量瓶，用甲醇定容，搖勻，得對(duì)照品溶液。色譜圖見圖1。

圖1 穗花杉雙黃酮對(duì)照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of amentoflavone standard

2.4 供試品溶液的制備

將各供試藥材粉碎，過80目篩。精密稱取各供試樣品30 mg，置于10 mL容量瓶中，加入8 mL甲醇，冷浸過夜，用超聲破提取儀提取40 min，放冷后用甲醇定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品溶液，照2.2項(xiàng)下的色譜條件，依次進(jìn)樣 2、4、6、8 和 10 μL，記錄相應(yīng)的色譜面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，系列對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸。回歸方程為Y=6×104X-30529，r=0.9999，穗花杉雙黃酮進(jìn)樣量在0.08～0.40 μg之間呈良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度考察

日內(nèi)精密度:取對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，求得穗花杉雙黃酮峰面積積分值的RSD為0.52%，表明儀器的日內(nèi)精密度良好。

日間精密度:取對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)三天，每天連續(xù)進(jìn)樣6次，求得穗花杉雙黃酮峰面積積分值的RSD為1.38%，表明儀器的日間精密度良好。

3.3 重復(fù)性考察

精密稱取5份卷柏生品，按2.4項(xiàng)下方法制備成供試溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣，每次10 μL，測(cè)得穗花杉雙黃酮含量的RSD為0.19%，表明重現(xiàn)性良好。

3.4 穩(wěn)定性考察

取卷柏生品，按2.4項(xiàng)下方法制備成供試溶液，在上述色譜條件下，分別于 0、2、4、8、16 h 吸取供試品溶液10 μL，進(jìn)樣分析并記錄峰面積，穗花杉雙黃酮的含量的RSD為0.78%，表明樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的卷柏生品9份，每份15.0 mg，置于10 mL容量瓶。將樣品隨即分為三份，各加入0.13 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.2 mL，按2.4項(xiàng)下方法制成供試品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣，吸取供試品溶液10 μL進(jìn)行分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1測(cè)得穗花杉雙黃酮的加樣回收率在95.00% ～98.46%之間，RSD為1.23%(n=9)。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recoveries of amentoflavone at three concentration levels

0.120 0.065 0.183 96.91 0.120 0.065 0.184 98.46 0.120 0.130 0.252 96.92 0.120 0.130 0.250 95.38 0.120 0.130 0.251 96.15 0.120 0.160 0.272 95.00 0.120 0.160 0.273 95.62 0.120 0.160 0.277 98.13

3.6 樣品含量測(cè)定

取卷柏生品，焦卷柏和卷柏炭藥材，按2.4項(xiàng)下方法制備成供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，吸取供試品溶液10 μL進(jìn)行分析，平行做3次。結(jié)果見圖2和表2。

圖2 卷柏生品及不同炮制品的 HPLC色譜圖，A卷柏生品;B焦卷柏;C卷柏炭Fig.2 HPLC chromatograms of sample extracts of S．tamariscina(A)，fried S．Tamariscina(B)and S．tamariscina coke(C)

表2 樣品測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Quantification results of the three samples(n=3)

4 討論

本文首次采用HPLC法對(duì)卷柏不同炮制品中穗花杉雙黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明不同炮制方法后，卷柏中穗花杉雙黃酮的含量變化較大。焦卷柏的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卷柏生品，而卷柏炭的含量較卷柏生品又有明顯降低。清炒過程中溫度升高，使藥材質(zhì)地變的疏松，有利于黃酮的提取，致使穗花杉雙黃酮含量增加;而炒炭溫度過高使其含量降低的原因可能是溫度過高黃酮被破壞。應(yīng)用時(shí)要根據(jù)不同的需要，采用不同的炮制方法。

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