大孔樹脂混用技術分離純化桑葉總酚

王 藝，彭國平*，歐陽臻，李存玉，鄭云楓，李賀敏，李紅陽

1南京中醫藥大學藥學院，南京 210023;2江蘇大學藥學院，鎮江 212013

桑葉為桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥葉。有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目之功效。主治風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤暈花等癥。現代藥理學研究表明，桑葉可抑制血糖升高，具有預防和治療糖尿病的作用，這與桑葉中含有的酚類成分有關［1］，所以對桑葉中酚類成分的研究成為目前桑葉研究的熱點之一。

目前，對酚類成分的富集方法主要有大孔樹脂富集［2］，聚酰胺富集［3］。其中大孔樹脂以其成本低，操作方便等特點被廣泛用于總酚的吸附純化，王俊［4］等利用大孔樹脂分離純化桑葉總黃酮，陳偉［5］等利用大孔樹脂聯用技術制備升麻總酚酸。但是大孔樹脂一次富集得到的總酚純度不高，二次上柱則又繁瑣耗時。本研究在對桑葉總酚進行富集純化時對大孔樹脂型號進行了篩選，研究樹脂混合使用的新工藝方法。對樹脂混合比例以及上樣量、濃度、流速和洗脫劑濃度進行考察，并通過試驗重復驗證。本研究對主要成分富集提供了一種新穎的分離途徑，且方法簡單易操作，為工業生產提供了一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Spectrum 752型紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司);Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);LIBROR AEL-40SM電子天平(十萬分之一);KQ-100B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);PTHW型電熱套(鞏義市英峪予華儀器廠);TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)。

桑葉采自江蘇大學校園內，晾干，經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定為桑葉;咖啡酸對照品(批號110885-200102，中國藥品生物制品檢定所);大孔樹脂(HPD400、HPD826、HPD417、HPD722、HPD100、HPD600、D101、ADS-17，均購于河北滄州寶恩化工有限公司);其它試劑均為國產分析純。

1.2 大孔樹脂預處理

用95%乙醇浸泡過夜，濕法裝柱，水洗至無醇味，用2.5 BV(樹脂體積)的5%NaOH溶液洗脫至無色，后用水洗脫至中性;再用2.5 BV的5%HCl洗脫至無色，用水洗脫至中性，備用。

1.3 桑葉水提液的制備

取粉碎過篩的桑葉藥材適量，加14倍(生藥量)的水回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮，加水溶解至每1 mL含0.5 g生藥，過濾，備用。

1.4 桑葉總酚的制備

分別取經過預處理的大孔樹脂 HPD400、HPD826、HPD417、HPD722、HPD100、HPD600、D101和ADS-17各200 mL，裝柱，取桑葉提取液(含生藥量120 g)，共8份，以濃度100 mg/mL，上樣流速為10 mL/min上樣，樹脂用 70%乙醇洗脫。另取HPD400和HPD826樹脂各100 mL，混合均勻，同法操作得洗脫液。

1.5 HPLC檢測條件

流動相:乙腈(A)-0.5%乙酸水(B);洗脫梯度(0～5 min:30%A;5～10 min:30%→35%A;10～15 min:35%→40%A;15～18 min:40%→50%A;18～40 min:50%→80%A);檢測波長358 nm;色譜柱:Hedera C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。

1.6 MS條件

ESI離子源:源電壓為3.5 kV;正、負離子檢測;鞘氣(N2)流速80 a.u.;輔助氣(N2)流速15 a.u.;碰撞氣體為He;毛細管溫度為250℃;毛細管電壓±5 V。采用全離子掃描方式，掃描范圍m/z 120～1000。

1.7 桑葉總酚含量測定方法

1.7.1 標準曲線的制備

精密稱取咖啡酸對照品適量，用60%乙醇溶解，制成1 mg/mL的溶液作為咖啡酸對照液。精密吸取對照液 0.5、1、2、4、8 mL 各兩份，分別置于 10 mL容量瓶中，一份分別加30%乙醇定容至10 mL作空白溶液;一份精密加入5%Na2SO3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，再精密吸取10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，然后加入1 mol/L NaOH 4 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min，做供試品溶液。利用分光光度法，分別取空白溶液和供試品溶液在510 nm波長出測定吸光度。以吸光度之差為縱坐標y，以咖啡酸濃度為橫坐標x，進行線性回歸，得回歸方程 y=0．4233 x+0.0028，R2=0.9991，對照在0.05 ～ 0.8 mg/mL 線性良好。

1.7.2 樣品含量測定

精密量取樣品，兩份，適當稀釋后，按照1.6.1項下，從“分別置于10 mL”，到“在510 nm波長出測定吸光度”，然后帶入標準曲線計算得桑葉中總酚的含量。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂型號的優選

指紋圖譜是中藥質量控制的有效手段，本研究采用HPLC檢測各種大孔樹脂對桑葉提取物的富集信息，比較各有效部位的指紋圖譜信息，并通過LC/MS技術和標準品驗證識別相關標志性色譜峰，優選出富集能力較好的大孔樹脂。

本研究對 HPD400、HPD417、HPD100、HPD600、HPD722、HPD826、D101和 ADS-17八種大孔樹脂進行比較分析。如圖1所示，HPD400和HPD826的富集成分的指紋圖譜的色譜峰的強度和數量均優于其他6種大孔樹脂。HPD826對峰1、2和3的對應物質的吸附能力明顯優于HPD400;HPD400對峰5和6所對應物質的吸附能力則較優。將HPD400和HPD826以1∶1(v/v)進行混合，該混合樹脂對峰1、2、3、5和6所對應物質的吸附能力均較優。

本研究采用LC/MS技術和UV分析法，分別對大孔樹脂富集得到成分進行結構鑒別和含量測定，以佐證混合樹脂對桑葉提取物中總酚類物質的較優的富集能力。LC/MS分析結果見表1。由表1可見，圖1中峰1 ～5，6，9和10對應峰物質分別為新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、槲皮素-3，7-二氧葡萄糖苷、咖啡酸、5-O-咖啡酰莽草酸、蘆丁和槲皮素。

經UV分析法分析，對八種大孔樹脂和混合樹脂所獲得的總酚的質量進行綜合評分。綜合評分=總酚轉移率×0.5+總酚質量分數×0.5。總酚轉移率和總酚質量分數是按以下方法計算得出:取“1.4”項下各種單一樹脂包括混合樹脂所得的乙醇洗脫液，根據“1.6.1”項下總酚含量測定方法測得每個樹脂洗脫的總酚質量，并求出總酚從提取液中到乙醇洗脫液的轉移率;同時精密量取部分洗脫液，干燥，稱重，算出總酚的質量分數。如表2所示，HPD400和HPD826各自吸附的總酚轉移率和綜合評分均優于其他樹脂，這和液相檢測圖譜數據一致。兩者混合后的混合樹脂圖譜綜合評分也變高，進一步的驗證了上述液相的分析結果。

綜上分析，本研究選取HPD400和HPD826兩種大孔樹脂進行混合使用，以期較好的富集桑葉提取物中的總酚類成分。

表 1 HPLC-ESI-MS 分析結果［6-10］Table 1 Results of HPLC-ESI-MS analysis

圖1 不同樹脂吸附總酚的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of total phenols extracted from different resins

2.2 HPD826和HPD400混合比例的篩選

進一步對優選出的HPD826和HPD400兩種樹脂的混合比例進行研究，以獲得較優的富集效果。取 HPD826 和 HPD400 適量，按照 0.5∶1;1∶1;2∶1;3∶1的不同體積比混合成200 mL，分別裝柱，按照“1.4”項下裝柱，同法操作，得乙醇洗脫液，以上述的綜合評分為指標。如表3所示，兩者體積比例為1∶1時明顯優于其它所考察比例，效果最好。故最終確定HPD826和HPD400的混合體積比為1∶1。

表2 不同樹脂洗脫的總酚含量比較Table 2 Comparison of contents of total phenols from different resins

2.3 總酚純化工藝的優選

總酚的純化工藝除了要求選擇較好的富集材料，對于純化過程的試驗參數，如上樣量、上樣濃度、上樣速度、洗脫劑的濃度等，也需進行考察。

表3 HPD400和HPD826混合比例的篩選Table 3 Determination of the ratio of HPD400 and HPD826

圖2 泄漏曲線Fig.2 Leakage curve

2.3.1 泄漏曲線

取經過預處理的混合大孔樹脂200 mL，藥液濃度為以桑葉藥材生藥量計為100 mg/mL，上樣流速為6 mL/min，每200 mL(即生藥量20 g)為一流份，按照“1.6.2”項下方法檢測總酚含量，結果見圖2。當生藥量超過180 g時，總酚濃度陡然上升，出現明顯泄漏，因此為在保證總酚的同時又能增大上樣量，初步選擇160 g生藥量作為上樣量。

2.3.2 桑葉總酚富集工藝的因素考察

2.3.2.1 正交實驗

取經過預處理的大孔樹脂200 mL，9份。選取上樣量(生藥量)、上樣濃度、上樣流速和乙醇濃度四個因素作為考察因素，設計正交因素水平表，見表4。以綜合評分作為考察指標，選用L9(34)正交表進行實驗。實驗結果見表5，方差分析見表6，從直觀分析可看出:四個因素對試驗結果影響大小次序為A＞C＞D＞B;從方差分析結果可見上樣量對試驗結果有顯著性影響，上樣濃度影響最小，從節省時間考慮選擇濃度最大的水平3，綜合選擇最佳工藝為A2B3C1D2，即上樣量160 g，上樣濃度150 mg/mL，上樣流速10 min/mL，60%乙醇洗脫。2.3.2.2 工藝驗證實驗

表4 因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal design

表5 正交實驗結果Table 5 Design and results of Orthogonal Design test

均值1 62.600 62.100 64.033 62.033均值2 64.967 62.733 62.500 63.633均值3 60.100 62.833 61.133 62.000極差4.867 0.733 2.900 1.633

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

按上述最佳工藝進行驗證實驗，重復三次，結果三次實驗總酚轉移率的±s為(73.6±1.1)%;質量分數±s為(64.1±1.2)%;綜合評分±s為(69.0±0.9)%，結果證明工藝穩定性良好。

3 討論

目前運用大孔樹脂分離純化總酚比較普遍，但多采用單一樹脂或者樹脂聯用等純化方式。單一樹脂吸附會損失一定的成分，也有著總酚純度不高的缺點;樹脂聯用技術工藝相對繁瑣。本文通過篩選樹脂發現兩種型號大孔樹脂混合起來使用有著很好的效果，從液相圖上看能使各個時間段的峰都能很好的加以保留，而且總酚得率及純度也都有所提高。在保證質量的同時，提高了效率，但是目前僅對桑葉總酚進行了富集工藝分析，本實驗室下一步會逐步采用樹脂混用技術，研究中藥其它成分的富集的工藝，明確成分的分離原理，闡明成分的富集分離過程。

本文通過對桑葉總酚富集工藝進行研究，確定了HPD400和HPD826兩種樹脂作為桑葉總酚的純化樹脂，兩種樹脂的最佳混合比例為1∶1(v/v)。兩種樹脂雖然極性相近，但都有各自的特征性吸附，HPD826的吸附原理是氫鍵吸附，能較好的保留一些多酚類及有機酸類成分如桑葉中的綠原酸等;HPD400是中極性的，能較好的吸附一些極性適中的成分如桑葉中的咖啡酸莽草酸和黃酮類成分。兩者混合使用可以把兩者的吸附特點結合起來，形成互補，達到對桑葉中有效成分的最大保留。

在樹脂篩選中，應該以有效成分的富集為目標，篩選適宜的樹脂以及混合比例或者聯用方式，提升大孔樹脂技術在中藥成分分離的中的適用性。

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