口服戊酸雌二醇對自然更年期大鼠超敏C反應蛋白的影響

楊樹琳 阮祥燕 蔣 輝 王 迎

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京100026;2.首都醫科大學實驗動物部，北京100069)

△作者現單位，首都醫科大學附屬北京朝陽醫院京西院區婦產科

流行病學認為激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)不應用于已經罹患動脈粥樣硬化的女性［1］，但是否可應用于動脈粥樣硬化的一級預防結果存在爭議［1－2］。血管慢性炎性反應過程被認為是動脈粥樣硬化的中心環節［3］。C反應蛋白(C－reactive protein，CRP)、白介素 6(interleukin－6，IL－6)目前被公認為慢性低度炎性反應的標志物［4－6］，即使調整生活方式和代謝危險因素仍可作為炎性反應標志物。多項研究［7］顯示CRP是2型糖尿病、動脈粥樣硬化與心血管事件的預測因素。戊酸雌二醇是臨床上常用的天然口服雌激素，本研究采用雌性自然更年期Sprague－Dawley(SD)大鼠建立自然絕經模型，探討戊酸雌二醇灌胃給藥對自然更年期大鼠血清超敏C反應蛋白(high sensitivity C－reactive protein，hs－CRP)與IL－6水平的影響，為絕經期婦女激素補充提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

15月齡健康無特殊病原體(specific－pathogen free，SPF)級雌性SD大鼠70只，體質量330～520 g，由北京維通利華實驗動物中心提供〔實驗動物許可證號:SCXK(京)2006－0009〕。SD大鼠飼養于首都醫科大學屏障環境動物室，室溫22℃ ～26℃，濕度為40% ～60%，晝夜明暗交替時間比為12 h∶12 h，自由飲水和采食，房間定時通風消毒。所有實驗均經首都醫科大學倫理委員會批準。

1.2 主要實驗儀器與試劑

全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)，電熱恒溫培養箱(DH4000A，天津泰斯特公司)，大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒ESBL4287(美國EVER 公司)，大鼠卵泡刺激素(follicle－stimulating hormone，FSH)ELISA試劑盒 RE056(美國 Biosource公司)，大鼠超敏C反應蛋白(hs－CRP)ELISA試劑盒ESBL4484(美國 EVER公司)，大鼠白介素6(IL－6)ELISA試劑盒R6000B(美國RD公司)。

1.3 藥物及用量

戊酸雌二醇(廣州先靈藥業有限公司生產，批號:國藥準字J20080036)。大鼠灌胃計算公式參照文獻［8］:戊酸雌二醇劑量(mg·kg－1)=6.25 ×2/60(mg·kg－1)≈0.21 mg·kg－1。戊酸雌二醇用無菌 0.9% 氯化鈉注射液配制成戊酸雌二醇混懸液。動物每周定時測體質量，根據體質量計算每只大鼠每次需要灌胃量。

1.4 方法

1.4.1 樣本量計算

1.4.2 動物模型的制備及分組

1)動物模型的制備:9月齡大鼠100只，每天定時取大鼠陰道脫落細胞于光學顯微鏡下觀察。正常育齡期大鼠有規律動情周期:包括動情前期、動情期、動情后期和動情間期［9］。根據陰道細胞形態判斷大鼠動情周期存在狀態［10］。動情前期:以底層細胞即圓核上皮細胞為主，少量的角化細胞和粒細胞;動情期:角化上皮細胞為主;動情后期:主要為粒細胞和角化細胞;動情間期:粒細胞為主，少量有核上皮細胞和黏液。連續觀察36個動情周期(6個月，從9月齡至15月齡)后，篩選出陰道脫落細胞檢查呈持續無角化狀態，動情周期消失(預示即將或已經進入更年期)的70只大鼠，以自然老化法建立自然更年期模型大鼠建立。

2)分組:為排除實驗時體質量干擾，對實驗大鼠按體質量排序，采用數字表法隨機分組［11］，將大鼠分為實驗組和對照組，每組35只。分組后，以獨立樣本t檢驗對2組大鼠平均體質量進行兩兩比較，實驗開始前實驗組大鼠體質量為(420.16±24.76)g，對照組為(419.96±23.84)g，兩組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

大鼠喂養1周適應后，實驗組大鼠開始用戊酸雌二醇0.9%氯化鈉注射液混懸液(1 mg戊酸雌二醇溶于10 mL 0.9%氯化鈉注射液中制成混懸液)按照2.1 mL·kg－1灌胃，對照組給予等量0.9%氯化鈉注射液。實驗組灌胃期間意外死亡1只，對照組在此期間也意外死亡1只。2組大鼠每天灌胃1次，灌胃14周后腹主動脈取血后處死，血液標本經3 500 r·min－1離心10 min，取血清于1.5 mL EP管中，－80℃冰箱保存待測。

1.4.3 性激素、hs－CRP 及 IL－6 檢測

競爭酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清雌二醇(estradiol，E2)和卵泡刺激素(follicle－stimulating hormone，FSH)濃度以及hs－CRP及IL－6水平。終止反應后30 min內，檢測450 nm吸光度。所有檢測均按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0進行數據處理。所有實驗數據經 One－Sample Kolmogorov－Smirnov 檢驗其是否符合正態分布，正態分布數據以均數±標準差(ˉ±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠灌胃14周各檢測指標正態性檢驗結果

灌胃14周時，實驗組與對照組各檢測指標均符合正態性分布(P＞0.05)，詳見表1。

表1 實驗組與對照組各檢測指標正態性檢驗結果Tab.1 Normality distribution result of each index in the two groups

2.2 實驗組與對照組大鼠E2和FSH水平比較

灌胃14周，實驗組血清E2水平高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05);實驗組血清FSH水平低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 實驗組與對照組大鼠灌胃14周血清E2、FSH水平比較Tab.2 The comparison of E2 and FSH levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表2 實驗組與對照組大鼠灌胃14周血清E2、FSH水平比較Tab.2 The comparison of E2 and FSH levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

* P ＜0.05 vs control group;E2:estradiol;FSH:folliclestimulating hormone.

Group E2/(ng·L－1) FSH/(IU·L－1)Treatment 61.831±10.950* 3.887±2.070*Control 55.653±7.716 5.292±2.472

2.3 灌胃14周，實驗組與對照組大鼠血清hs-CRP水平比較

灌胃14周，自然更年期大鼠實驗組血清hs－CRP水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，詳見表3。

表3 實驗組與對照組大鼠灌胃14周hs-CRP水平比較Tab.3 The comparison of hs-CRP levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表3 實驗組與對照組大鼠灌胃14周hs-CRP水平比較Tab.3 The comparison of hs-CRP levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

* P ＜0.05 vs control group;hs-CRP;high sensitivity C－reactive protein.

Group hs－CRP/(pg·mL －1)Treatment 130.18±55.96*0.000 Control 190.82±80.73 P

2.4 灌胃14周，實驗組與對照組大鼠IL-6水平比較

灌胃14周，自然更年期大鼠實驗組血清IL－6較對照組有降低趨勢(P＞0.05)，但兩組之間差異無統計學意義，詳見表4。

表4 灌胃14周兩組大鼠血清IL-6水平的比較Tab.4 The comparison of IL-6 levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

表4 灌胃14周兩組大鼠血清IL-6水平的比較Tab.4 The comparison of IL-6 levels in the rats of treatment and control groups(ˉ±s，n=34)

IL-6:interleukin－6.

Group IL－6/(pg·mL －1)Treatment 44.65±40.28 Control 49.66±22.71 P 0.549

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化心臟病(以下簡稱冠心病)是絕經女性死亡的主要原因。近年來，研究者發現冠心病是慢性炎性反應性疾病［12］，研究［13］結果表明女性隨著激素水平的下降，促炎性反應的水平會升高。本研究選擇與心血管疾病風險密切相關的炎性反應因子 hs－CRP 和 IL－6，絕經婦女 hs－CRP 水平的研究一直是研究的熱點，但結論尚有爭議［14］，考慮 hs－CRP是一種非特異性的炎性反應因子，受機體多方面影響。本研究結果顯示自然更年期大鼠體內hs－CRP水平升高，雌激素補充可以降低自然更年期大鼠血清hs－CRP的水平，不影響自然更年期大鼠血清IL－6的水平。

hs－CRP是在感染和組織損傷時血漿中快速升高的主要急性期蛋白之一，它由肝臟細胞合成并可在其他局部組織及部位(如動脈粥樣硬化斑塊中)的部分細胞內合成。hs－CRP的檢測具有敏感、準確和可重復性的特點，在冠心病、腦卒中、周圍血管栓塞等疾病診斷和預測中發揮越來越重要的作用［15－16］。近年流行病學研究［17］結果證實，hs－CRP與左室肥厚、急性冠狀動脈綜合征、胰島素抵抗密切相關，并可預測冠心病、腦卒中的風險及預后［18］。絕經女性體內雌激素的降低同時伴隨體內hs－CRP的升高會使絕經女性相對更加脆弱［19］。2004年，美國疾病控制和預防中心(CDC)與美國心臟病協會(AHA)聯合發表炎性反應標志物與心血管疾病指南［20］，認為 hs－CRP在缺血性心臟病中是一種可靠和重要的標志物，美國心臟病學會推薦hs－CRP水平為評價冠心病人群危險度分層的依據之一，其中hs－CRP≥3 mg/L為高危人群的標準，hs－CRP超過20 mg/L需要考慮有無感染等其他非冠心病因素存在。

白細胞介素－6(IL－6)是相對分子質量為26 000的糖蛋白，主要由單核、巨噬細胞分泌，是肝臟急性時相反應的有力誘導劑，是肝臟C反應蛋白的主要刺激因子，作為重要的促炎性反應細胞因子，其在心血管等相關慢性病中的作用受到越來越多的關注。實驗研究［21］表明IL－6可通過誘導內皮細胞的趨化因子和黏附分子的表達、釋放，促進白細胞浸潤，削弱內皮細胞產生內源性一氧化氮的能力，介導巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫細胞，上調編碼卵磷脂膽固醇酰基轉移酶及載脂蛋白A－I的基因表達，致動脈粥樣硬化損害的發展，對遠期心血管事件具有預測價值［22］。臨床及動物實驗［23］也均已證實，急性心肌梗死后IL－6血清濃度增高。雌激素對IL－6的影響結果存在爭議，有橫斷面研究［24］闡明絕經婦女較絕經前婦女IL－6水平無明顯差異。Wakatsuki等［25］針對結合雌激素的研究發現血清炎性反應因子包括IL－6與雌激素劑量相關，大劑量可升高炎性反應因子水平，而低劑量則不會對血清炎性反應因子有影響。本研究發現自然更年期大鼠實驗組血清IL－6較對照組有降低趨勢，差異無統計學意義。推測本實驗所用臨床常用雌二醇換算劑量給予大鼠灌胃給藥并沒有升高自然更年期大鼠血清IL－6的水平。激素補充治療對絕經婦女hs－CRP及IL－6水平的影響與激素種類、劑量及給藥途徑有關，口服戊酸雌二醇后可降低自然更年期大鼠血清hs－CRP水平，不升高IL－6水平，從而有利于降低心血管疾病的風險，為臨床激素補充治療提供一些理論參考。

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