雙側黑質注射脂多糖引起大鼠迷走神經背核膽堿能標志物降低和便秘

張 悅 鄭麗飛 宋 瑾 樊瑞芳 陳長亮 朱進霞

(首都醫科大學基礎醫學院生理與病理生理學系，北京100069)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種好發于中老年人中樞神經系統的退行性疾病，常伴有消化系統方面的功能異常，如便秘等［1］，其主要病理特征為中腦黑質部位多巴胺能神經元缺失。近年來研究［2］表明腦內炎性反應可能是PD的一個主要致病因素，小膠質細胞介導的慢性炎性反應是PD病變過程的重要組成部分。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一種以氨基苷為組成單位的磷脂，構成革蘭陰性菌細胞壁成分［3］，是一種很強的小膠質細胞激活劑，可誘導小膠質細胞激活，釋放致炎因子和細胞毒性因子導致多巴胺(dopamine，DA)能神經元變性［4］。Herrera 等［5］認為LPS注入黑質可以作為研究炎性反應對DA系統影響的最佳動物模型。

DA是一種抑制性神經遞質，主要由中腦黑質產生，沿黑質—紋狀體投射系統分布，儲存于紋狀體。臨床研究［6］發現PD患者黑質中DA能神經元缺失伴有內源性DA含量的改變，而胃腸動力會隨之發生變化。DA對胃腸功能具有調節作用，如可以調節鈉的吸收［7］，刺激消化道上皮離子轉運［7－8］，抑制胃腸蠕動［9－11］以及黏膜血流量［12］。

DA除了在黑質—紋狀體系統有大量分布外，在中樞其他核團也有DA能神經元的存在，如下丘腦［13］、孤束核、迷走運動背核(dorsal motor nucleus of the vagus，DMV)［14－15］等，支配上消化道的迷走神經副交感節前纖維大部分來源于DMV。支配胃腸運動的DMV內含有膽堿能神經元和 DA 能神經元［16－17］，并且研究［18－19］發現PD患者DMV部位的神經元也有退行性表現。

本研究通過制作LPS誘導的PD大鼠模型，觀察模型組和對照組大鼠DMV中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase，ChAT)的分布情況，并檢測該模型大鼠排便情況，以期為PD患者便秘的發病機制提供一些實驗依據。

1 材料和方法

1.1 LPS處理PD模型大鼠的制備

選取20只雄性SD大鼠(首都醫科大學實驗動物部提供)，實驗動物許可證號:SCXK(京)2012－0001。體質量為250～300 g，經實驗動物福利委員會許可，動物在室溫條件，正常更替光照，24h食水供應，采用數字表法將其隨機分為實驗組和對照組，LPS處理組大鼠12只、對照組8只。

模型制備:LPS處理組大鼠12只，用水合氯醛進行麻醉(0.4 g/kg)后，將大鼠頭部固定于立體定位儀，顱骨暴露出2點(黑質坐標:前囟后5.6 mm，旁開±2.0 mm，深度7.5 mm)，從這2點注入脂多糖(lipoplysaccharide，LPS，購自美國 Sigma公司)，每點注入2 μL，濃度為2 g/L。飼養3周后成模。

1.2 行為學觀察

實驗動物成模后進行行為學觀察記錄，每天從15點到16點對大鼠的攝食量、飲水量、體質量及糞便進行觀測，連續觀察1周并進行統計。

1.3 HE 染色

將黑質部位的切片晾干后用蒸餾水洗凈，蘇木精染色3～10 min，自來水洗去多余的蘇木精。鹽酸乙醇分色10 s，自來水漂洗20 min，使蘇木精藍化細胞核呈藍色。蒸餾水清洗后，以1%伊紅染色3 min，蒸餾水洗去多余伊紅。上行梯度乙醇脫水，組織依次通過70%、80%、90%、95%乙醇各1 min，然后2次進入100%乙醇脫水各5 min。用二甲苯透明2次各5 min，封片照相。

1.4 免疫組織化學

取材:成模大鼠及對照組大鼠用4%多聚甲醛進行灌流固定，完成后取腦，將腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中，次日將組織浸泡于15%蔗糖溶液中，第3日換至30%蔗糖溶液中，梯度脫水。

待腦組織完全脫水后，按黑質和DMV所在部位切塊包埋，冰凍切片機切厚度為20 μm腦片，漂片于多聚賴氨酸處理的載玻片上，過夜晾干。

DMV區域的切片，經檸檬酸鹽緩沖液中微波抗原修復后，自然降至室溫。先后經PBST緩沖液、甘氨酸、PBST洗片。用5%驢血清封閉50 min，選用一抗分別為酪氨酸羥化酶(TH，小鼠抗大鼠，1∶5 000稀釋，購自美國Sigma公司)、膽堿乙酰轉移酶(ChAT，山羊抗大鼠，1∶100稀釋，購自Abcam公司)，4℃過夜孵育。15～16 h后取出組織切片室溫放置1 h，PBST洗3次。滴加二抗(驢抗山羊、驢抗小鼠，購自Invitrogen公司)，孵育 2 h后滴加 DAPI，5 min后PBST洗片，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察、照相。

黑質區域的切片則只選用酪氨酸羥化酶(TH，小鼠抗大鼠，1∶5 000稀釋，購自美國Sigma公司)一抗進行單標染色，其他步驟不變。

1.5 統計學方法

應用GraphPad Prism 5.0進行統計學處理。數據以均數±標準誤(ˉx±SE)表示，結果來自3批獨立的實驗。結果中的“n”代表動物只數。組間比較行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠黑質部位注射LPS的帕金森動物模型鑒定

TH是DA合成的限速酶，可以作為DA能神經元的標志物。從HE染色結果(圖1A和B)可以看出，LPS大鼠黑質部位的神經元數量明顯減少，并伴有膠質細胞的增多。免疫組織化學的結果顯示LPS大鼠黑質部位的TH免疫陽性神經元的數量和熒光強度明顯低于對照組(圖1C和D)。以上結果表明LPS大鼠黑質部位的DA能神經元減少，由此可見，LPS處理的PD大鼠模型造模成功。

圖1 HE染色及TH免疫陽性神經元在LPS組和對照組大鼠黑質的分布Fig.1 HE staining and tyrosine hydroxylase(TH)immunoreactivity in the substantia nigra(SN)of LPS and control rats

2.2 LPS組與對照組大鼠行為學比較

LPS大鼠在成模后檢測了其每天的體質量變化，結果發現差異無統計學意義〔圖2A，對照組:(6.02±0.84)g，LPS 組:(7.12 ±0.80)g，n=6，P=0.36)〕。每天食物的攝入量〔對照組:(26.70±1.02)g，LPS組:(27.98±0.84)g，n=6，P=0.36〕和攝水量〔對照組:(46.13±2.78)g，LPS組:(49.23 ±2.40)g，n=6，P=0.42〕2組之間差異無統計學意義(圖2B)。但其糞便濕質量〔對照組:(53.80±2.45)g，n=8，LPS組:(43.95±2.98)g，n=9，P ＜0.05〕和含水量〔對照組:(17.31 ±1.59)g，n=8，LPS 組:(10.68 ±1.72)g，n=9，P＜0.05〕，LPS組明顯低于對照組(圖2C)。此外，從大鼠排出的糞便情況也可以看出LPS組大鼠排出的糞便量明顯少于對照組，且比較干燥(圖2D)。以上結果提示LPS大鼠出現便秘癥狀。

2.3 TH、ChAT在LPS組和對照組大鼠DMV中的分布差異

眾所周知，DMV在調節胃腸動力方面發揮著重要的作用。本研究用免疫組織化學的方法觀察了TH和ChAT(膽堿能神經元的標志物)在大鼠DMV中的分布。TH(紅色)免疫陽性神經元和纖維主要分布在DMV及孤束核，ChAT(綠色)免疫陽性神經元和纖維主要分布在DMV及舌下神經核(圖3)。從圖3中可以看出對照組和LPS模型組TH和ChAT在背側延髓的分布情況一致。但是DMV中的TH免疫陽性神經元和纖維的熒光強度及數量在LPS組明顯高于對照組;而ChAT免疫陽性神經元的熒光強度及數量則低于對照組。

3 討論

本實驗通過用LPS損毀黑質部位DA能神經元制備的PD大鼠模型，觀察到LPS大鼠出現便秘情況、DMV部位的TH免疫熒光強度增強而ChAT熒光強度明顯減弱。

DMV在調節胃腸功能方面發揮著重要的作用，如胃腸的運動功能。DMV中含有多種神經元，其中大多數是膽堿能神經元，也含有其他神經元如DA能神經元。TH是合成DA的限速酶，存在于DA能細胞內，可用于標記DA能細胞;DA能神經元釋放的DA是一種抑制性神經遞質，具有強烈的舒張平滑肌和舒血管的作用，可抑制胃腸道的緊張性。ChAT是膽堿能神經元的標志物，可標記膽堿能神經元。膽堿能神經元釋放的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)則是一種常見的興奮性神經遞質，具有刺激胃腸平滑肌收縮和促進胃腸蠕動的作用［20］;從本研究的實驗結果也可以看出在大鼠DMV有TH和ChAT免疫陽性神經元的存在，而它們在分布和功能上存在的差異性提示可能對胃腸功能調節發揮著不同的作用。

本實驗中，用LPS損毀黑質炎性反應模型大鼠的黑質部位DA能神經元較對照組明顯減少并伴有膠質細胞的增生，標志著LPS已通過激活小膠質細胞使DA能神經元退化，動物模型造模成功。LPS大鼠出現排出的糞便量明顯減少且糞便較干燥，提示LPS大鼠出現了類似于PD患者的便秘的表現。便秘可以是2種主要因素引起，一是運動障礙;二是結腸對水分的重吸收增多。為了探索LPS大鼠便秘的原因，筆者研究了支配胃腸運動的DMV部位DA的標志物TH和膽堿能神經元的標志物ChAT的免疫反應性變化，發現該部位TH免疫熒光強度顯著增高而ChAT則明顯降低。抑制性神經遞質DA在DMV部位的增多，一方面可通過與膽堿能神經元突觸前膜上的D2受體結合［21］，進而抑制該神經元釋放ACh到消化道部位，另一方面由DMV直接釋放到胃腸部位，引起胃腸部位的DA增多，這兩條通路都可抑制胃腸動力。相反，興奮性神經元遞質ACh在LPS大鼠DMV部位的減少，從而使直接釋放到胃腸的ACh也可能減少，引起胃腸動力興奮的作用減弱。胃腸動力興奮作用的減弱和抑制作用的增強，這2種情況都使消化道整個轉運時間延長，從而導致大鼠排出的糞便量減少。由于消化道動力的減弱，使糞便在結腸部位停留的時間延長，糞便中的水分可能被結腸黏膜吸收增多，出現大便干燥硬結的情況，最終LPS大鼠表現出類似于PD患者的便秘情況。關于LPS大鼠結腸黏膜對水吸收功能的變化還有待進行進一步的研究。上述結果的產生可能是由于黑質部位DA能神經元損傷之后通過直接或間接地神經纖維的聯系使DMV部位的神經元發生可塑性改變，進而導致胃腸運動功能紊亂，即胃腸動力減弱。該結果與筆者之前在6－OHDA大鼠觀察到的結果［16，22］一致。

綜上所述，LPS破壞大鼠黑質DA能神經元后，經一系列神經可塑性變化，導致DMV處的DA含量增多、ACh含量減少。從而使DMV通過神經纖維傳遞到胃腸的DA增多及ACh減少，進而引起大鼠出現便秘。但由SN神經元損傷引起DMV部位神經遞質發生變化的機制尚不明確，還有待于進行進一步的研究。

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