心力衰竭大鼠肺臟α1A及β1、β2腎上腺素受體表達的改變

蔣志麗 李艷芳* 曹芳芳 劉 飛 白雪源 呂 楊

(1.首都醫科大學附屬北京安貞醫院心內科，北京100029;2.中國醫學科學院北京協和醫學院阜外心血管病醫院心外科，北京100037;3.解放軍總醫院腎科，北京100853)

α1－AR和β－AR在調節肺臟血流、支氣管平滑肌的舒縮及肺泡液體清除等方面有著重要作用［1－2］，但有關腎上腺素能受體各亞型在心力衰竭肺臟表達水平變化的報道較少，為此，我們采用心肌梗死后心力衰竭大鼠肺臟進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級近交系Wistar大鼠，雄性，10周齡，體質量250～280 g，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，首都醫科大學附屬北京安貞醫院清潔級動物房飼養，實驗動物許可證號:SCXK－(軍)2007－004。動物房溫度維持在(22±3)℃，相對濕度為(50±20)%。

1.2 實驗試劑

抗 α1A－AR 和抗 β1－AR，β2－AR 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 心肌梗死后心力衰竭模型制作

大鼠稱體質量后以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉，備皮，仰臥固定，行氣管插管，連接動物呼吸機(潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶1)，監測心電圖。常規強力碘消毒，于胸骨左側第4肋間開一橫切口，暴露心臟，由左心耳下方2～3 mm結扎左冠狀動脈前降支。結扎即刻心電監護顯示肢導 R 波振幅明顯升高，隨后 I、II、III、avL、avF 和 V3導聯ST段弓背向上抬高＞0.2 mv，并呈動態演變過程，1周時復查心電圖可見病理性Q波為心肌梗死模型制作成功，心肌梗死4周后做超聲心動圖檢測示左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)≤45%為心力衰竭模型成功標志［3］。

1.4 超聲心動圖檢測心功能

檢測前以1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥固定。探頭置于胸前，探頭頻率10 mHz，圖像深度2.5cm。取胸骨旁左室長軸及短軸切面進行測量，測量參數包括左室舒張末期內徑(left ventricular diastolic diameter，LVDD)，左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVSD)，左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)，每項指標均測量3個心動周期，結果取平均值。

1.5 實驗分組及組織提取

35只雄性Wistar大鼠，分為正常對照組(10只)和假手術組(10只)，其余15只大鼠制作心肌梗死模型，心肌梗死4周后心力衰竭模型制作成功10只，繼續喂養8周后存活9只。將以上3組大鼠以1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，開胸取肺組織，立即置于－80℃冰箱保存待測。

1.6 Western blotting

采用 Western blotting 法檢測肺組織 α1A－AR、β1－AR、β2－AR的蛋白表達水平。1)組織裂解:提取肺組織質組織總蛋白，采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。2)SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制:5%積層膠+10%分離膠。3)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳:用微量加樣器吸取蛋白質樣品，按預定的順序加入加樣孔，上樣量約每孔100 μg(β－actin為內參照);以100v進行恒壓電泳2 h，直到溴芬藍到達分離膠底部。4)轉膜:采用硝酸纖維素膜，石墨電極半干轉，以恒流1 mA/cm2凝膠電泳轉移1 h;用麗春紅染液對硝酸纖維素膜上的蛋白質條帶進行染色。5)免疫印跡顯色:將結合蛋白的硝酸纖維素膜放入塑料袋加入封閉液置于4℃冰箱過夜;根據抗體說明書加入一抗，各受體亞型一抗的稀釋濃度分別為 α1A－AR:1 ∶200;β1－AR:1 ∶200;β2－AR:1∶100;室溫2 h，TBST 洗膜;按1 ∶2 000 加入辣根過氧化物酶偶聯二抗，置于37℃搖床溫育45 min，TBST洗膜;于硝酸纖維素膜上滴加DAB液，膠片顯影。用掃描儀對膠片進行掃描成像。應用吸光度分析測定蛋白的表達水平。

1.7 統計學方法

用Quantity one軟件對圖像進行吸光度分析，以目的條帶與內參照條帶信號強度的比值代表組織中目的受體的表達水平。用SPSS13.0進行統計分析。計量數據以均數±標準差(±s)表示。多樣本均數比較采用單因素方差分析，如樣本間差異有統計學意義，采用Newman－Keuls檢驗法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 α1A-AR蛋白表達水平的改變

α1A－AR蛋白在A組、B組和C組的表達水平分別為0.52±0.11，0.49±0.08，0.36±0.06，C 組與 B 組相比出現顯著下調(P＜0.05)，A組與B組相比差異無統計學意義(P＞0.05)(圖1，表1)。

2.2 β1-AR和β2-AR蛋白表達水平的改變

β1－AR蛋白在A組、B組和C組的表達水平分別為0.34±0.06，0.35±0.07，0.27±0.04，C 組與 B 組相比出現顯著下調(P＜0.05)，A組與B組相比差異無統計學意義(P＞0.05)(圖1，表1)。

β2－AR蛋白在A組、B組和C組的表達水平分別為0.30±0.06，0.31±0.05，0.46±0.08，C 組與 B 組相比出現顯著上調(P＜0.01)，A組與B組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。(圖1，表1)。

圖1 各組α1A-AR，β1-AR，β2-AR在肺臟中的蛋白表達水平Fig.1 Expression of α1A-AR，β1-AR and β2-AR subtypes protein levels in the lung of each group

表1 各組大鼠肺臟α1A-AR和β-AR，β2-AR各亞型的蛋白表達水平Tab.1 Expression of α1A-AR，β1-AR and β2-AR subtypes protein levels in the lung of each group

3 討論

腎上腺素受體分為 α－AR和 β－AR 2種類型，α－AR 分為 α1－AR 和 α2－AR 2 大類，α1－AR 又分為 α1AAR、α1B－AR、α1D－AR 3 種亞型，β－AR 分為 β1－AR、β2－AR、β3－AR 3 種亞型。肺臟組織中 α1A－AR、α1B－AR、α1D－AR 3 種亞型均有表達，但以 α1A－AR 的表達為主［2，4］。α1A－AR 參與肺臟血管收縮，并與 β2－AR 共同調節肺臟通氣/血流比值。但也有研究［5］認為，α1BAR和 α1D－AR在肺臟動脈收縮中起著一定作用。α1B－AR、α1D－AR 和 α2－AR 還參與肺臟靜脈收縮的調節［6］。大鼠肺臟組織中 β1－AR、β2－AR、β3－AR 3 種亞型均有表達［7］，但 β2－AR 在其中占主導地位，是調節肺臟生理功能的主要受體亞型。β1－AR、β2－AR 不僅分布于肺臟呼吸道上皮細胞、平滑肌細胞上，而且在肺血管平滑肌上也有表達，β1－AR、β2－AR 的表達隨著支氣管管徑逐漸變細而表達數量逐漸增多，β2－AR所占的比例也逐漸增大。肺泡上皮中表達的β－AR幾乎全部是 β2－AR［8－9］。激動肺臟 β2－AR 會導致支氣管平滑肌舒張、肺泡液體清除率增加、肺組織鈉離子通道的開放等［8］。在肺泡性低氧血癥、氧化應激損傷等情況下，α－AR和β－AR表達水平發生變化，以適應病理狀態下的肺臟功能。

本實驗結果表明，與假手術組相比，慢性心力衰竭大鼠肺臟 α1A－AR、β1－AR 表達水平顯著下調，而 β2－AR顯著上調。這與慢性心力衰竭大鼠心臟α1－AR和β－AR 表達水平改變不同。多數研究［10－13］顯示慢性心力衰竭心臟 β1－AR 下調，α1A－AR 上調［9－12］。而目前有關β2－AR在心力衰竭時的變化則眾說紛紜，Mwtlu等［14］認為，慢性心力衰竭時心臟 β2－AR 表達不變，但Du等［12］認為，心力衰竭心臟 β2－AR 下調。有關心力衰竭肺臟腎上腺素受體表達的變化迄今為止尚未見報道，本研究發現，慢性心力衰竭肺臟 β1－AR、α1A－AR均下調，β2－AR上調，在國內外尚屬首例。肺臟與心臟表達水平不一致的原因可能與分布于不同器官的腎上腺素受體介導不同的生理功能有關。分布在心臟的 β1－AR、β2－AR 激動后產生心肌的正性變時、變力作用。心力衰竭時，交感－腎上腺素系統被激活，導致心臟的 β1－AR和 β2－AR被蛋白激酶 A和 β－AR激酶磷酸化而脫敏或由于受體mRNA表達水平減少而下調［10，15－17］，進而受體對激動劑的反應性減弱，興奮－收縮脫耦聯，出現心肌收縮力下降。激動心臟的α1AAR可介導心臟的正性變力效應［11］，慢性心力衰竭時心臟的α1A－AR代償性上調，力圖發揮增強心肌收縮力、抑制細胞凋亡，防止心肌重塑的作用［12］。與心臟α－AR和β－AR表達水平的改變有所不同，在肺臟發揮生理功能的受體主要是 α1－AR和 β2－AR。生理情況下，肺循環系統的β2－AR作用占優勢，有利于肺血管舒張和抑制平滑肌增生［9］;CHF肺循環淤血，肺靜脈壓升高，肺毛細血管擴張，左心衰初期的肺靜脈壓升高會被肺毛細血管網緩沖，不會即刻引起肺動脈高壓。只有左心功能不全加重，導致長時間的肺靜脈高壓，超過肺毛細血管網的緩沖能力，才會影響肺動脈壓力，出現肺動脈高壓和右心功能不全。本研究中，和假手術組相比，心衰模型組α1A－AR表達明顯下調，究其原因，一方面因為本實驗模型為心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，主要累及左心功能，尚未發展到右心功能不全，另一方面α1A－AR下調可能是機體的一種代償反應，α1A－AR的下調能舒張肺小動脈、抑制血管平滑肌的增生，從而延緩肺小動脈收縮導致肺動脈高壓的進程，對右心功能起到保護作用。心力衰竭時，肺臟β2－AR表達上調一方面可以進一步發揮舒張血管和支氣管平滑肌作用，而且激動β2－AR能夠通過開放鈉離子通道等機制促進肺水腫液的清除、并能改善心力衰竭條件下肺臟微血管的通透性［13］。心力衰竭時肺臟β1－AR的下調一方面與慢性心力衰竭時交感腎上腺素系統激活產生的負反饋調節有關，另一面也與代償性拮抗β2－AR的上調，維持相對穩定的肺泡液體清除率有關。

綜上所述，心力衰竭時肺臟腎上腺素受體的變化是為了適應肺臟病理變化的需求，因此，對于心力衰竭時保護肺臟的治療應以局部激動β2－AR及阻滯α1A－AR為主，這與調節心力衰竭時心臟腎上腺素受體表達水平變化的治療方案不同。

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