激肽釋放酶14在卵巢癌組織中的表達及臨床意義

顏秋梅 李巧云 聞立紅

激肽釋放酶14在卵巢癌組織中的表達及臨床意義

顏秋梅 李巧云 聞立紅

目的探討激肽釋放酶14(kallikreinl4)在卵巢癌組織的表達及臨床意義。方法應用SP和ELISA法檢測不同卵巢患者KLK14蛋白的表達和KLK14血清學的濃度。結果卵巢癌組KLK14蛋白表達陽性率/血清學濃度明顯高于卵巢良性上皮腫瘤組和正常卵巢組。KLKl4蛋白表達與卵巢癌患者的臨床分期，組織學分級有關。結論KLKl4過表達與卵巢癌的發生、侵襲相關，提示其可能成為卵巢癌的標志物。

腫瘤標志物；卵巢上皮性惡性腫瘤；KLKl4；SP；ELISA

激肽釋放酶14(human kallikrein14)KLK14是人類激肽釋放酶家族的1個成員，分子生物學實驗證實它在卵巢癌組織中高度表達與卵巢癌的預后相關，提示其可能成為卵巢癌的標志物[1]。卵巢癌患者就診時已處于晚期階段，至今缺乏有效的診斷、監測，尋找能用于卵巢癌早期診斷的腫瘤標志物十分必要。

本試驗應用SP和ELISA法檢測了卵巢上皮性癌、良性上皮腫瘤、正常卵巢中KLKl4的蛋白表達情況及不同卵巢組血清中KLK14 的濃度變化，分析KLKl4蛋白在不同卵巢組中的表達及其與卵巢癌的臨床病理之間的關系，探討KLK14在卵巢癌發生侵襲中的作用，為卵巢癌的早期診斷提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 標本取自2004年至2011年我院卵巢腫瘤手術切除標本65例。良性上皮腫瘤24例(漿液性囊腺瘤15例、粘液性囊腺瘤9例)，上皮性卵巢癌41例(漿液性囊腺癌30例、粘液性囊腺癌11例)，上皮性卵巢癌為首發病例，年齡32～73歲，平均年齡50.5歲，3個月內未應用任何激素治療及化放療，同期取子宮切除術中正常卵巢10例，手術病理分期1988(FIGO)：Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期21例，Ⅳ期6例。高分化10例，中分化12例，低分化19 例。

1.2方法

1.2.1SP：PBS代替一抗為陰性對照，已知KLKl4蛋白陽性的乳腺癌石蠟切片為陽性對照。胞漿有棕色顆粒者為KLKl4陽性細胞，光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞數占總細胞數的百分比，取5個視野的算術平均值。①根據顯色細胞的比例計分：陽性細胞為0%計0分，陽性細胞<10%計1分，陽性細胞10%～50%計2分，陽性細胞51%～80%計3分；陽性細胞80%計4分。②根據細胞染色強度計分：0分癌細胞無著色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色。積分=染色強度×陽性細胞數，積分范圍0～12分，>4分為陽性表達。

1.2.2ELASA：血清標本取自術前2 d空腹肘靜脈全血3 ml，置于未加抗凝劑的試管中， KLKl4測定根據說明書向被包有特異性單抗的微孔中準確加入50 μl緩沖液再加50 μl標準品或標本，室溫震蕩孵育1 h，再加100 μl曲生物素標記的第二抗體溶液，室溫震蕩孵育1 h，洗滌后加入酶結合物，室溫震蕩孵育30 min后洗滌，加底物液室溫孵育30 min,加終止液后，在450nm處測其吸光度。然后根據所測血清標本的吸光度求出其KLKl4濃度。以正常對照組的均值±1.9個標準差，即95%可信區間值上限值作為KLKl4陽性標準[2]。

1.3統計學方法 統計學方法采用SPSS 11.0，計量資料比較應用t檢驗，計數資料應用χ2。以P<0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1kLK14的表達KLK14主要表達卵巢上皮組織細胞的細胞漿，卵巢組織中的KLK14的陽性表達見表1。

2.2卵巢癌KLK14 陽性表達率與臨床病理的關系，見表2。

2.3不同卵巢組血清學濃度表達，見表3。

表1 KLK14蛋白在各卵巢組織中表達情況(例，%)

表2 KLKl4蛋白的表達與卵巢癌病理關系(例， %)

表3 卵巢癌、良性上皮卵巢腫瘤、正常婦女血清KLK14的濃度值例)

3 討論

KLK14 是2012年由Youself GM等利用候選基因位置克隆法定位出的一段序列，是激肽釋放酶基因家族成員，位于19q13.3～19q13.4 染色體上，全長6349bp，在激素相關性組織組織中高表達，如乳腺、前列腺、睪丸等器官的腫瘤組織。

目前發現腫瘤侵襲對細胞外基質的降解是一個重要步驟，其中需要多種降解酶，尤其腫瘤細胞分泌的蛋白酶能降解細胞外基質是腫瘤侵潤轉移的分子基礎和先決條件，活化后的KLK14具有雙重活性即胰島素樣糜蛋白酶活性，能夠有效水解層黏連蛋白5和膠原質IV等細胞外基質，促進腫瘤細胞突破基底膜，穿透細胞外基質，進而促使腫瘤細胞侵襲臨近正常組織或轉移至遠處發生惡性增殖，因而，KLKl4在惡性腫瘤細胞的發生進展中發揮重要作用，原發惡性腫瘤細胞產生分泌的蛋白酶量，從側面可能反映了腫瘤細胞自身的侵襲與轉移能力，檢測KLK14蛋白的表達，可能有助于診斷和監測卵巢癌的侵襲與轉移[3-5]。

本研究發現，KLK14 主要表達于卵巢上皮組織細胞的細胞漿，正常卵巢，卵巢上皮良性腫瘤及卵巢癌組織中，KLK14 陽性表達率分別為20%(2/10)，20.8%(5/24)，63.4%(25/41)，KLK14在早期卵巢癌(Ⅰ、Ⅱ期)組織中表達陽性率為42.8%(6/14)，低于晚期卵巢癌(Ⅲ、Ⅳ期)組織中表達陽性率70.3%(19/27)；說明隨著卵巢癌的臨床進展，KLK14表達水平隨之升高。本研究同時檢測了同期手術正常卵巢，卵巢上皮性良性卵巢腫瘤及卵巢癌患者的血清KLK14 水平，結果卵巢癌組血清KLK14濃度明顯升高,血清學上與免疫組化結果一致，均提示KLK14 蛋白與卵巢癌的惡性行為關系密切。有望成為新的腫瘤標記物。

[1] Felber LM， Kundiq C， Borgono CA，et al.Mutant recombinant serpins as highly specific inhibitors ofhuman kallikrein 14.FEBS J,2006,273(11):2505-2514.

[2] Qikonomopotlou K， Hansen KK， Saifeddine M， et al. Kallikrein-mediated cell Signalling:targeting proteinase-activated receptors(PARs). Biol Chem,2006,387(6):817-824.

[3] Borgono CA， Michael IP， Shaw JL，et al.Expression and functional characterization of the cancer-related serine protease，human tissue kallikrein 14. J Biota Chem,2007,26,282(4):2405-2422.

[4] StefanssonK， BrattsandM， NvA， et al. Kallikrein-related peptidasel4 maybea major contributor to trypsin-like proteolytic activity in human stratum comenm. Biol Chem,2006,387(6):761-768.

[5] 史惠蓉，宋芷霜，張瑞濤，等.卵巢上皮性癌組織中人組織激肽釋放酶基因14的表達.鄭州大學學報(醫學版),2011，46(1):25-28.

Kallikrein14inovariancancertissuesanditsclinicalsignificance

YANQiu-mei,LIQiao-yun,WENLi-hong.

ObstetricsandGynecology,TheFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Henan450052,China

ObjectiveTo investigate the effect of kallikrein 14 (kallikreinl4) expression in ovarian carcinoma and its clinical significance.MethodsThe concentration of different ovarian patients with KLK14 protein was detected by SP and ELISA expression and KLK14 serology.ResultsThe expression of ovarian cancer group the positive rate of KLK14 protein in serum concentrations were significantly higher than benign epithelial ovarian tumor and normal ovarian group. The expression of KLKl4 protein in ovarian cancer patients with clinical stages, histological classification,ConclusionOverexpression of KLKl4 and ovarian cancer,invasiveness,suggesting that it may become a marker in ovarian cancer.

Tumor marker; Epithelial ovarian cancer; KLKl4; SP; ELISA

450052 鄭州大學第五附屬醫院婦產科