植酸酶高產(chǎn)菌株的選育

李彥芹，李春青，周潔芳，龐志多，王鳳華

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

植酸酶高產(chǎn)菌株的選育

李彥芹，李春青，周潔芳，龐志多，王鳳華

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

從土壤中分離到1株植酸酶高產(chǎn)菌株P(guān)e0，初步鑒定為米曲霉.為了提高植酸酶活力，對(duì)Pe0菌株分別進(jìn)行紫外線和亞硝基胍誘變處理，經(jīng)初篩、復(fù)篩、遺傳穩(wěn)定性能檢測(cè)，得到1株酶活相對(duì)較高、性狀相對(duì)穩(wěn)定的菌株P(guān)e2#，酶活穩(wěn)定在10.66 U/mL，較原始菌株提高到3.34倍.另對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適接種量為4%，最適pH為5.5，最適培養(yǎng)時(shí)間為6.5 d.在此基礎(chǔ)上進(jìn)行培養(yǎng)基正交優(yōu)化，結(jié)果表明：葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為4 g/L，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為2 g/L，MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)所得菌株產(chǎn)酶活力最高.

植酸酶；誘變；選育；發(fā)酵優(yōu)化

植酸(肌醇六磷酸)及其鹽類是植物種子中磷普遍存在的形式，是植酸性飼料中普遍存在的一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，因其在吸收過(guò)程中易于和動(dòng)物腸道內(nèi)的金屬離子，如Ca2+,Zn2+,Fe2+,Cu2+等，以及與蛋白質(zhì)形成不溶性絡(luò)合物[1]，所以在生物體內(nèi)的利用率很低.植酸酶(phytase)是催化植酸和植酸鹽水解成肌醇和六磷酸的一類酶的總稱，系統(tǒng)名稱為肌醇六磷酸酶，是一類特殊的酸性磷酸酶，可以抑制植酸對(duì)礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)的親和，解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，增加磷的利用率，降低農(nóng)業(yè)生態(tài)負(fù)擔(dān).目前在嬰兒食品、飼料的添加劑、廢棄物處理等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用.本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離純化的菌株P(guān)e0進(jìn)行誘變選育，獲得產(chǎn)酶活力高的突變株，并對(duì)其進(jìn)行性狀穩(wěn)定性研究及發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在得到產(chǎn)酶活力較高、性狀相對(duì)穩(wěn)定的菌株，以期對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐及科學(xué)研究提供一定的參考.

1 材料

1.1菌種

菌株P(guān)e0,本實(shí)驗(yàn)室分離純化菌種.

1.2試劑及培養(yǎng)基

甲酰胺，亞硝基胍，三重蒸餾水， pH 5.5的醋酸緩沖液，植酸鈉溶液，鉬酸銨試劑，釩酸銨試劑，釩鉬酸銨顯色/終止液，乳酸石炭酸棉藍(lán)染液；查氏培養(yǎng)基，初篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基[2]，液體發(fā)酵培養(yǎng)基[2].

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

ZHWY-2102型雙層大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器)；TDL-5型臺(tái)式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；722E可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器).

2 方法

2.1鑒定

將Pe0菌株根據(jù)《中國(guó)真菌志》[3]進(jìn)行菌種鑒定，觀察其菌落、分生孢子穗、分生孢子等的特征.

2.2酶活測(cè)定

取4支10 mL離心管，其中1支作空白對(duì)照，分別加入3.0 mL植酸鈉溶液，置于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后每隔1 min依次在反應(yīng)管中加入1.0 mL植酸酶提取液，在37 ℃水浴鍋中溫育30 min，每隔1 min加入4.0 mL釩鉬酸銨顯色/終止液，然后在空白管中加入1.0 mL植酸酶提取液，混合搖勻，4 000 r/min離心10 min.于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，參照磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活[4].

植酸酶酶活定義：在溫度為37 ℃,pH 5.5 的條件下，每min從濃度為5.0 mmol/L 植酸鈉溶液中釋放1 μmol無(wú)機(jī)磷，即為1個(gè)植酸酶活性單位，以U 表示[5].磷濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1.

酶活力單位定義：在37 ℃、pH 5.5條件下，在植酸鈉溶液中每min釋放1 nmol無(wú)機(jī)磷所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位.

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3誘變處理

將菌株P(guān)e0轉(zhuǎn)接到查氏培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d進(jìn)行活化.制備1～5×106mL-1的孢子懸液，分別進(jìn)行紫外線(15 W紫外燈30 cm處充分照射3，5，7，9 min)和亞硝基胍(300，400，500，600 μg / mL)的單因子誘變.經(jīng)過(guò)中間培養(yǎng)，初篩、復(fù)篩并采用釩-鉬酸銨法測(cè)酶活力，篩選酶活更高的菌株.

2.4菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性測(cè)定

將復(fù)篩得到的酶活高的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)5代，每代測(cè)定其酶活，判斷其遺傳穩(wěn)定性.

2.5發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)獲得的遺傳性能穩(wěn)定的菌株分別進(jìn)行接種量、pH、發(fā)酵時(shí)間[6]及培養(yǎng)基成分的優(yōu)化.

3 結(jié)果及討論

3.1菌種鑒定

將菌株P(guān)e0接種于查氏固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d后，菌落直徑平均為2.0 cm.最初菌落質(zhì)地疏松，為白色，后轉(zhuǎn)為黃色、黃褐色.分生孢子頭呈放射狀，其分生孢子梗有橫隔，分生孢子為球形或橢圓形(圖2).根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定為米曲霉(Aspergillusoryzae).

圖2 菌絲及孢子形態(tài)

3.2菌株的誘變

誘變得到200個(gè)菌株，對(duì)其中透明圈與菌落直徑比值較大的9株進(jìn)行復(fù)篩，其酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 菌株選育結(jié)果

誘變前后對(duì)比，菌落形態(tài)發(fā)生了一些變化：經(jīng)紫外線誘變后的平板菌落比原始菌平板菌落大且厚實(shí).這說(shuō)明菌體經(jīng)紫外線誘變作用，菌體基因確實(shí)受到影響，內(nèi)在基因的變化導(dǎo)致菌體表觀的改變，誘變效果較明顯.經(jīng)亞硝基胍處理的菌落形態(tài)無(wú)明顯變化.

紫外線誘變使植酸酶酶活由原來(lái)的3.19 U/mL最大增加到18.00 U/mL，為原始菌株的5.61倍；經(jīng)亞硝基胍誘變后，植酸酶酶活由原來(lái)的3.19 U/mL最大增加到22.81 U/mL，為原始菌株的7.15倍.由此可見(jiàn)，透明圈與菌落直徑比與酶活有一定的關(guān)系，但不完全是正相關(guān).綜合比較舍棄Pe1#，Pe1，Pe3.

3.3遺傳穩(wěn)定性

將篩選出的Pe2#，Pe3#，Pe4#，Pe2，Pe4，Pe5菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，其結(jié)果如表2所示.

表2 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

比較表2各菌株傳代的平均酶活，并進(jìn)行方差分析，其穩(wěn)定性最好的菌株為Pe2#,結(jié)果如表3，表4.

表3 誘變菌株P(guān)e2#的穩(wěn)定性

表4 Pe2#菌株傳代次數(shù)的方差分析

由表4的均方值看出，Pe2#菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性.通過(guò)方差分析，其組間差異的P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05，說(shuō)明傳代次數(shù)對(duì)酶活性變化影響不顯著，即傳代次數(shù)未對(duì)其產(chǎn)酶活性產(chǎn)生影響，表明其具有穩(wěn)定的遺傳性，因此對(duì)該株菌進(jìn)行下一步的研究.

3.4發(fā)酵條件優(yōu)化

3.4.1 最適接種量、pH、發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖3可知，隨接種量增加，酶活也不斷地增加，接種量為4%時(shí)，酶活達(dá)到最高，接種量接近7%時(shí)，酶活很低，可能由于接種量過(guò)大引起菌種內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，產(chǎn)酶能力降低.

由圖4可以看出，最適pH為5.5.當(dāng)pH低于5.5時(shí)，酶活在pH 4.5時(shí)高于pH 5，可能是由于粗酶液中含有植酸酶多種同功酶所致.當(dāng)處于堿性環(huán)境中，基本不產(chǎn)酶，但在pH 6.5時(shí)出現(xiàn)1個(gè)小峰值，可能是在此條件下酶活部分恢復(fù)所致[7].

由圖5可知，4～6 d，酶活逐漸增加，培養(yǎng)至6.5 d時(shí)，酶活顯著提高并達(dá)到最高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，酶活反而降低.所以其最適培養(yǎng)時(shí)間為6.5 d.

圖3 接種量對(duì)酶活的影響

圖4 pH對(duì)酶活的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活影響

3.4.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(表5)測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖(A),蛋白胨(B),(NH4)2SO4(C),MgSO4·7H2O(D),對(duì)Pe2#菌株產(chǎn)酶的影響.

表5 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表6 L9(34)正交表及實(shí)驗(yàn)分析

圖6 正交各因素水平效應(yīng)

由表6的R值數(shù)據(jù)及圖6綜合分析，各因素對(duì)產(chǎn)酶影響的大小依次為蛋白胨(B)>(NH4)2SO4(C)>MgSO4·7H2O(D)>葡萄糖(A)，其最佳組合為A3B3C2D1，即葡萄糖的質(zhì)量濃度為25 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為4 g/L，(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度為2 g/L，MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度為0.1 g/L .

表7 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

經(jīng)計(jì)算，發(fā)現(xiàn)A(葡萄糖)的極差(R=9.63)、均方差值相對(duì)于因素B(蛋白胨)、C因素((NH4)2SO4)和D(MgSO4·7H2O)的極差、均方差很小，F(xiàn)值不顯著，故對(duì)A不做方差分析，將其作為誤差項(xiàng).因素B(蛋白胨)、C((NH4)2SO4)和D(MgSO4·7H2O)的均方差相對(duì)較大(表7)，說(shuō)明其對(duì)米曲霉的產(chǎn)酶影響很大.

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從土壤中分離到1株植酸酶高產(chǎn)菌株P(guān)e0，初步鑒定為米曲霉，對(duì)Pe0菌株分別進(jìn)行紫外線和亞硝基胍誘變處理，經(jīng)初篩、復(fù)篩、遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，得到1株酶活相對(duì)較高、性狀相對(duì)穩(wěn)定的菌株P(guān)e2#，酶活穩(wěn)定在10.66 U/mL，較原始菌株提高到3.34倍，相較于張衛(wèi)兵[7]、王尊生等[8]實(shí)驗(yàn)得到的植酸酶活力提高1～3倍，并較常見(jiàn)曲霉屬微生物內(nèi)植酸酶的酶活顯著提高了10倍.另對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適接種量為4%，最適pH為5.5，最適培養(yǎng)時(shí)間為6.5 d.在此基礎(chǔ)上進(jìn)行培養(yǎng)基正交優(yōu)化，結(jié)果表明,葡萄糖質(zhì)量濃度為25 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為4 g/L，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為2 g/L，MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)所得菌株產(chǎn)酶活力最高.本研究為該菌株更好地服務(wù)于飼料、食品等行業(yè)提供了一定的參考依據(jù).

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Screeningofphytase-producingstrain

LIYanqin,LIChunqing,ZHOUJiefang,PANGZhiduo,WANGFenghua

(College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

In order to get the mutant strain which was stable and high production of phytase, the originalAspergillusoryzaestrain Pe0 isolated in our laboratory was the staring strains, which were mutagenized separately by UV and nitrosoguanidine. By preliminary screening, rescreening and the detection of genetic stability, Pe2# was obtained which had a relatively high activity and stable characteristics. Its stable activity was 10.66 U/mL, which increased 3.34 times comparing with original strain. To determine the optimum conditions for its enzyme productions, the fermentation conditions were optimized. The composition of the optimum medium were 25 g/L glucose, 4 g/L peptone,2 g/L (NH4)2SO4and 0.1 g/L MgSO4·7H2O.

phytase；mutagenesis；screening；fermentation optimization

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.04.011

2011-11-20

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(201305001)

李彥芹(1965-)，女，河北滿城人，河北大學(xué)副教授，主要從事微生物和免疫學(xué)研究.

E-mail:liyanqin88@yahoo.com.cn

Q935

A

1000-1565(2013)04-0394-07

(責(zé)任編輯趙藏賞)