微波輔助提取梵凈山陽荷多糖的工藝優化*

陳仕學，沈家國，陳波，王大忠，張廷海

(銅仁學院生物科學與化學系，貴州 銅仁，554300)

陽荷(Zingiber strioatum)，又名洋姜、山姜、野山姜等，屬于姜科姜屬多年生草本植物。陽荷是一種營養價值很高、食藥同源的膳食纖維蔬菜，富含蛋白質、氨基酸和豐富的膳食纖維多糖類物質［1］。其多糖具有極其重要的生理功能，如降血脂、延緩衰老、抗腫瘤等功效。目前對陽荷的研究主要有色素和蛋白質的提取研究，而對陽荷多糖的提取研究未見報道，原因是多糖的結構組成非常復雜，提取分離十分困難，所以選擇一種合適的提取分離方法對陽荷多糖的研究具有重大意義［2］。本研究采用微波法輔助提取陽荷多糖，為進一步開發利用本地野生陽荷及后續研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:野生陽荷，將采于梵凈山附近林中的野生陽荷，洗凈，切碎，曬干，置于60℃烘箱干燥，室溫密封保存備用。

試劑:NaOH 固體，天津市大茂化學試劑廠;Cu-SO4，廣東汕頭市西隴化工廠;無水乙醇、95%乙醇，天津市富宇精細化工有限公司;蒽酮 國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖 天津市恒興化學試劑制造有限公司;鹽酸、濃硫酸、遵義師范學院化工試劑廠，以上試劑均為國產分析純;水為二重蒸餾水。

儀器:T6 新世紀型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;MM823EC8-PS(X)型美的微波爐，佛山市順德區美的微波電器制造有限公司;101-3 型電熱鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司;AR124CN 型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司;80-2 型離心沉淀機，江蘇金壇市中大儀器廠。

1.2 實驗方法［3－4］

選材→烘干→脫脂→烘干→粉碎→過篩→加浸提劑攪勻→微波處理→過濾→濾液濃縮→除蛋白→離心取濾液→脫色→無水乙醇沉淀→靜置12h→過濾→干燥

將已烘干的陽荷干品在常溫下用5 倍體積的乙酸乙酯浸泡3h，用蒸餾水清洗殘留的有機溶劑至樣品無味，將其置于60℃的烘箱內烘干，得脫脂樣品。在脫脂樣品中加入浸提劑，適當條件下微波處理，將樣品過濾，取濾液水浴濃縮至1/2 體積。用Sevag［V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1］試劑除蛋白，離心去沉淀，向濾液加入4%H2O2溶液除色素。并加入4倍體積無水乙醇室溫靜置12h，將沉淀物置于70℃干燥箱中干燥，平行實驗3 次，求平均值，計算多糖的提取率。

數據處理和圖表繪制用Microsoft Excel2003 和SPSS16.0 進行進行，平行實驗3 次，取平均值。

1.2.1 樣品溶液的制備

準確稱取經過干燥的陽荷(粉碎后過20 目篩)1.000 0 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入一定量的蒸餾水，用微波法對其進行多糖提取，在常溫下過濾，取濾液1 mL，加入5 mL 無水乙醇，搖勻，靜置24 h，3 000 r/min 離心20 min，去上清液，濾渣用2 mol/L H2SO4溶液溶解后，加水定容至10 mL，搖勻，備用。

1.2.2 葡萄糖標準溶液和蒽酮-硫酸試劑的配制

葡萄糖標準溶液配制:精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標準品10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL 的葡萄糖樣品溶液，備用。

2 mol/L H2SO4溶液:準確移取111.11 mL 濃H2SO4溶液，定容至1 L，用于溶解多糖。

蒽酮-硫酸溶液配制:精確稱取蒽酮粉末0.100 0 g 加入100 mL 的錐形瓶中，加入濃度為80% 的H2SO4，定容至100 mL，備用。

1.2.3 浸提劑的確定

分別用蒸餾水、不同濃度的乙醇溶液作為陽荷多糖的浸提劑，用紫外分光光度計測出吸光度，得出最佳浸提劑。

1.2.4 微波提取條件的優化［5－6］

分別以最佳浸提劑為溶劑，對不同料液比、浸提時間和功率進行單因素試驗，并對料液比、時間和功率采用L9(33)進行正交試驗，通過正交分析，得出微波提取陽荷多糖的最佳提取工藝參數。

2 結果與分析［7 －10］

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

分別從葡萄糖樣品溶液中精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于試管中，加蒸餾水定容至2 mL，精密加入蒽酮-硫酸溶液6 mL。置于沸水中加熱15 min 后取出，放入冰浴中冷卻，以相應的空白試劑作對照，在波長為625 nm 下，以吸光度A 為縱坐標，葡萄糖含量c(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線(見圖1)，得回歸方程為:A=0.0364C+0.0624，R2=0.9992。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

由此可以得出多糖提取率的計算公式:

提取率/% =［(A－0.062 4)/0.036 4 ×10 ×V/m/1000］×100

式中:A為吸光度;m為稱取陽荷質量，g;V為浸提液體積，mL。

2.2 浸提劑的確定

用不同體積分數的乙醇和蒸餾水為浸提劑提取陽荷多糖，結果見表1。

表1 不同浸提劑對提取率的影響Table 1 Influence of different extracting agent on the extraction ratio

由表1 可知，本實驗用70%的乙醇作為提取陽荷多糖的最佳浸提劑。

2.3 單因素實驗

2.3.1 提取時間的影響

準確稱取過20 目篩干燥陽荷粉1.000 0 g，料液比為1∶20(g∶mL)，中火(440 W)下分別提取1、2、3、4、5 min。按1.2.1 中樣品溶液的制備及2.1 中標準曲線制作的方法分別實驗，測其吸光度，并代入回歸方程中求其多糖提取率，實驗結果見圖2。

圖2 作用時間對提取率的影響Fig.2 Influence of different acting time on the extraction ratio

由圖2 可知，隨著提取時間的延長，陽荷中多糖的提取率逐漸增加，在4 min 時多糖的提取率達到最大，超過4 min 后，多糖提取率隨時間的延長逐漸下降?？赡苁嵌嗵堑慕雎蔬_到了動態平衡，多糖氧化分解速度逐漸增加所致，故選擇4 min 作為進一步優化提取條件的浸提時間。

2.3.2 料液比的影響

準確稱取1.000 0 g 陽荷粉，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)，中火(440 W)作用下浸提4 min，按1.2.1 中樣品溶液的制備及2.1 中標準曲線的制作方法分別實驗，測其吸光度，并代入回歸方程中求其多糖提取率，實驗結果見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Influence of different solid-liquid ratio on the extraction ratio

由圖3 可知，料液比為1∶30(g∶mL)之內時，多糖提取率逐漸增加，料液比超過1∶30(g/mL)后，提取率逐漸下降，這可能是多糖的溶出率已達到平衡，過多的溶劑造成多糖的損失。故選擇1∶30(g∶mL)作為進一步優化提取條件的最佳料液比。

2.3.3 微波功率的影響

準確稱取1.000 0 g 陽荷粉，料液比1 ∶30(g/mL)，微波功率分別為低火(136 W)、中低火(264 W)、中火(440 W)、中高火(616 W)、高火(800 W)下浸提4 min。按1.2.1 中樣品溶液的制備及2.1 中標準曲線的制作方法分別實驗，測其吸光度，并代入回歸方程中求其多糖提取率，結果見圖4。

圖4 微波功率對提取率的影響Fig.4 Influence of different microwave power on the extraction ratio

由圖4 可知，隨著提取功率的增加，陽荷多糖的提取率隨之增加，當提取功率為中低火時達到最大，之后隨提取功率的增加而逐漸下降?？赡苁怯捎诠β实脑黾釉斐啥嗵茄趸纸馑?，故選擇提取功率為中低火作為進一步優化提取條件的最佳功率。

2.4 正交試驗

為了確定在提取過程中各因素的影響大小，本研究對微波法提取陽荷多糖的3 個單因素即提取時間(A)、料液比(B)、微波功率(C)進行正交試驗，并以多糖提取率作為提取工藝的判斷依據。根據設置選用L9(33)正交表，試驗方案設計及結果見表2 和表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 The factor levels of the orthogonal test

表3 正交試驗結果及極差分析Table 3 The results of orthogonal test and range analysis

由表3 極差分析結果顯示，3 個因素對陽荷多糖提取率的影響依次為:提取時間＞微波功率＞料液比。正交優化條件為A1B1C2，即提取時間為3 min，料液比為1∶20(g∶mL)，微波功率為中火(264 W)。

2.5 驗證性實驗［11］

為了考察上述工藝的穩定性，按微波法提取陽荷多糖的最佳工藝條件A1B1C2，即提取時間為3 min，料液比為1∶20(g∶mL)，提取功率為中火的條件下分別進行重復性試驗5 次，分別測定其多糖提取率，計算其RSD ，結果見表4。

表4 驗證實驗結果Table 4 The verification testing results

由表4 可知，在此工藝條件下，多糖平均提取率為13.01%，優于正交實驗中任何一組，RSD 為0.44%，說明該工藝穩定。

2.7 三種提取方法比較［12］

同法采用常規浸提法得出陽荷多糖的最佳提取條件為:料液比為1∶40(g∶mL)，提取時間為80 min，提取溫度為90℃，陽荷多糖的提取率平均值為5.05%;超聲波輔助法最佳提取條件料液比為1∶30(g∶mL)，提取時間為30 min，提取溫度為70℃，在此條件下陽荷多糖的提取率平均值為8.18%。3 種提取方法比較見表5。

表5 常規提取、超聲波與微波提取法效率比較Table 5 The comparation of the extraction efficiency among the conventional method，ultrasonic method and the microwave-assisted method

由表5 可知，微波輔助提取法具有提取時間短、耗材少、提取效率高等優點，故可用于工業上大規模生產。

3 結論

本試驗采用微波法、常溫浸提和超聲波法提取陽荷多糖，對陽荷多糖的提取工藝進行了優化。微波輔助提取的最佳工藝條件為:浸提時間3 min，料液比1∶20(g∶mL)，微波功率為中火，多糖的提取率為13.01%，且穩定性高;采用常規浸提法的最佳提取工藝條件為:料液比1∶40(g∶mL)，浸提時間80 min，浸提溫度90℃，多糖的提取率平均值為5.05%;超聲提取的工藝條件:料液比1∶30(g∶mL)，浸提溫度70℃，浸提時間30 min，超聲功率100 W，多糖提取率為8.18%。采用微波法輔助提取陽荷多糖具有操作簡單，時間短，提取率高，能耗低等優點，可以廣泛用于工業上多糖的生產。

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