血清蛋白質指紋圖譜對晚期結直腸癌一線化療效果的預測作用

沈虹 袁瑛 李晶晶 房雪峰 譚純文 余捷凱 鄭樹

·論著·

血清蛋白質指紋圖譜對晚期結直腸癌一線化療效果的預測作用

沈虹 袁瑛 李晶晶 房雪峰 譚純文 余捷凱 鄭樹

目的尋找能預測晚期結直腸癌一線化療療效的血清蛋白標記物。方法選擇2008年8月至2010年7月在浙江大學醫學院附屬第二醫院的70例從未接受過治療的晚期結直腸癌患者，其中44例患者接受FOLFOX方案化療，26例患者接受FOLFIRI方案化療，進行4個療程治療后使用RECIST評價標準區分化療受益者(R)和化療無效者(NR)。留取化療前患者血清標本，采用SELDI-TOF-MS和人工神經網絡對一線化療的療效進行預測分析。結果根據RECIST標準，42例患者為化療受益者，28例患者為化療無效者，分析兩組患者血清蛋白質指紋圖譜的差異，篩選出10個蛋白質峰在化療受益組的表達明顯高于化療無效組；并由這10個峰構建出結直腸癌一線化療療效的預測模型。經交叉驗證，該模型的總準確率為90.0%(63/70)。結論蛋白質指紋圖譜模型是預測晚期結直腸癌患者一線化療方案治療效果的有效方法之一。

生物學標記； 結直腸腫瘤； 蛋白質陣列分析

全身化療是治療晚期結直腸癌患者最主要的手段。5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸鈣聯合奧沙利鉑(FOLFOX)或伊立替康(FOLFIRI)治療方案是兩個標準的一線化療方案，其有效率均約為40%，因此仍有一些患者要面對化療失敗、疾病進展的可能。對于這兩個一線方案的選擇，目前臨床上未有明確的標記物可用來預測療效并選擇出各自適合的患者。因此，如能找到合適的預測手段，在化療前就能將對某一種化療方案的受益人群篩選出來，進行個體化的治療，這將有益于患者的治療及預后。

SELDI-TOF-MS作為近年來發展起來的蛋白質組學研究手段，能夠直接對臨床樣本進行檢測，結合生物信息學分析將有可能從患者血清樣本的大量蛋白質和多肽信息中篩選出具有不同意義的潛在標志物，并建立起具有較高診斷效力的蛋白質指紋圖譜檢測模型。本研究應用SELDI蛋白質芯片對晚期結直腸癌患者中經一線化療方案治療的受益者和無效者的血清蛋白質指紋圖譜進行檢測，結合人工神經網絡模型(artificial neural network，ANN)和支持向量機等生物信息學方法，初步建立了蛋白質指紋圖譜晚期結直腸癌化療敏感性的預測模型，并探討了該模型在晚期結直腸癌患者經一線化療方案治療的療效預測方面的應用價值。

資料與方法

一、資料

收集2008年8月至2010年7月在浙江大學附屬第二醫院接受治療的70例經病理確診為轉移性結直腸癌患者，每例患者均可進行確切的療效評估。所有患者均為初治或近6個月內未行化療及其他抗腫瘤藥物治療者。其中男性37例，女性33例；年齡42～74歲，中位年齡60歲；結腸癌44例，直腸癌26例；高、中、低(包括黏液腺癌及印戒細胞癌)分化腺癌分別為16例、30例、24例；轉移器官為2處的9例,3處以上9例，其余為單器官轉移；肝轉移41例,肺轉移26例,腹膜轉移9例，腹膜后轉移2例，骨轉移3例。

化療期間不采用其他抗腫瘤治療方式，包括放療、手術、免疫治療等。經本院倫理委員會同意，所有患者均簽署知情同意書。收集所有患者首次化療前的血清，所有血樣均于清晨空腹采集，在無抗凝劑的5 ml普通采血試管中室溫靜置1～2 h，使血液凝固析出血清，2 000 r/min離心5～10 min，冰浴上分裝血清于0.5 ml的Eppendorf管中，每管20～50 μl，-80 ℃低溫冰箱保存備用。

二、化療方案

FOLFOX或FOLFIRI方案化療4個療程。(1)FOLFOX方案：第1天靜脈滴注奧沙伯鉑85 mg/m2(體表面積)共2 h，亞葉酸鈣400 mg/m2(體表面積)共2 h；第1天靜永滴注5-FU 400 mg/m2(體表面積)共46～48 h，連續滴注2 d。(2)FOLFIRI方案：第1天靜脈滴注伊立替康180 mg/m2(體表面積)共30～90 min，亞葉酸鈣400 mg/m2(體表面積)與伊立替康180 mg/m2(體表面積)同時滴注共30～90 min;第1天靜脈滴注5-FU 400 mg/m2(體表面積)共46～48 h，連續滴注2 d。

療效評價：參照實體瘤的療效評價RECIST(response evaluation criteria in solid tumors)1.0標準分為：進展(progressive disease,PD)、穩定(stable disease,SD)、部分緩解(partial response,PR)和完全緩解(complete response,CR)。分別于4次化療后評價療效。臨床受益者為CR、PR或SD的患者；臨床無效者為PD的患者。

三、SELDI-TOF-MS

(一)實驗操作

血清標本冰浴中解凍，10 000 r/min離心5 min(4 ℃)，10 μl U9血清處理液中加入血清5 μl，搖床上振蕩使充分混合(4 ℃,600 r/min，30 min)。用Binding Buffer將U9處理后的血清稀釋至200 μl用于上樣，搖床上振蕩使充分混合(4 ℃,600 r/min，2 min)。取上述經U9處理并稀釋過的血清100 μl加到芯片上，芯片與血清充分反應1 h(4 ℃,600 r/min搖床上振蕩)后去除樣品。反應結束甩干芯片表面液體,依次以50 mmol/L乙酸鈉溶液(pH=4.10)清洗芯片3次,每次5 min;去離子水快速清洗2次。芯片自然干燥后點加100 μl SPA 2次,待干燥后行質譜儀檢測。

(二)數據處理與生物信息學分析

質譜儀參數設定為激光強度165，檢測靈敏度7，檢測上限60 000 m/z，優化收集數據范圍2 000 ～30 000 m/z(蛋白質質量和電荷比值,以下簡稱質荷比)，信號收集位置20～80，每個樣本取120個點收集信號的平均值。原始數據先以Proteinchip Software 3.2軟件校正，使總離子強度及分子量達到均一，并過濾噪音，設置初始噪音過濾值5(信號與噪音比值，signal/noise，S/N)，設二次噪音過濾值為2，以10%為最小閾值進行聚類。然后用t檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗(后者用于處理偏態分布數據)比較各組血清蛋白質指紋圖譜數據(由Proteinchip Software 3.2自帶的Biomarker Wizard 3.1軟件完成)，尋找各組之間表達有差異的蛋白質峰。將結直腸癌患者化療前血清蛋白質質譜數據導入ZJUCIPDAS網絡服務軟件。選擇受益組和無效組間差別最顯著的10個蛋白質峰或所有P值小于0.05的蛋白質峰數據進行分析，篩選出Youden指數最高的質荷比峰值組合，用SVM留一法和判別分析留一法建立模型。每組分析樣本為n個，在所有樣本中隨機抽取n-1個樣本設為訓練集用于建立模型，剩下的1個樣本作為測試集進行交叉驗證。如此抽樣、訓練及驗證過程重復n次，以期得到最為接近真實值的結果。最后同時輸出SVM、原始判別以及兩者交叉驗證的結果，并用時間序列分析的方法用二維散點圖的形式表示。

結 果

一、化療療效

70例行FOLFOX或FOLFIRI方案化療的結直腸癌患者，在4次化療后經RECIST標準判斷療效，42例被判斷為臨床受益者，28例為臨床無效者。臨床受益者：CR 0例，PR 22例，SD 20例

二、SELDI-TOF-MS結果

1.建立晚期結直腸癌化療療效預測模型:通過對晚期結直腸癌患者中42例化療受益者與28例無效者血清蛋白質質譜數據的比較，共檢測到蛋白質峰100個(信號與噪聲比值，S/N=5時)，其中表達差異有統計學意義(Plt;0.05)的蛋白質峰14個。通過交叉驗證，判別分析軟件篩選出10個蛋白質峰(質荷比為9286 m/z、9431 m/z、9375 m/z、9298 m/z、4304 m/z，9352 m/z，9404 m/z，4606 m/z，9198 m/z，3963 m/z)組合構建成的結直腸癌化療療效預測模型具有最高的總準確率(表1)。

2.模型訓練及交叉驗證：將這70份樣本隨機分成訓練組和測試組，進行交叉驗證，通過這10個蛋白峰的鑒別，42例化療受益的樣本中有39例被準確預測，28化療無效的樣本中有24例被準確預測。結果表明，該預測模型的靈敏度為90.7%(39/43)，特異度為88.9%(24/27)，總準確率為90.0%(63/70)(表2)。

討 論

結直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一。全身化療是晚期結直腸癌患者最主要的治療手段。氟尿嘧啶聯合亞葉酸鈣(5-FU+LV)方案是最經典的選擇。隨著奧沙利鉑和伊立替康分別在1996年和2002年在美國上市，大量的隨機臨床試驗均報道奧沙利鉑聯合5-FU、LV方案與伊立替康聯合5-FU、LV方案在晚期結直腸癌患者的治療中有較好的效果[1-5]。美國國家綜合癌癥網(NCCN)臨床指南指出FOLFOX(5-FU+LV+奧沙利鉑)和FOLFIRI(5-FU+LV+伊立替康)均可作為晚期結直腸癌患者的一線化療方案。這兩個方案的臨床有效率相當，均約為40%(CR+PR)。因此，仍有多數患者要面對化療失敗、疾病進展的可能。而臨床上至今并未有明確的標記物可用來預測化療療效和選擇適合的患者。因此，如能借助一些生物標記物在最初的治療中選擇合適的化療方案，將會極大減少治療的盲目性，減少病人痛苦，提高治療的有效率，繼而獲得生存率的提高。

目前在臨床上常用的結直腸癌腫瘤標記物有糖類抗原199、癌胚抗原等，其對腫瘤診斷及隨訪監測具有較高的價值，但這些腫瘤標記物的敏感性和特異性并不高，存在相當比例的“假陽性”和“假陰性”，且不能用于療效預測。PET-CT檢查等影像學手段常用來評價腫瘤治療的效果，由于靈敏度低限制了其應用于腫瘤療效的早期監測。因此，尋找有效的無創檢測手段、獲得相應的腫瘤標記物用于指導臨床治療是目前關鍵所在。

SELDI-TOF-MS蛋白質芯片系統已廣泛應用于多種惡性腫瘤的診斷，包括乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、消化系統惡性腫瘤[8]以及卵巢癌[9]等。相關研究報道中，已將SELDI-TOF-MS蛋白質芯片系統用于結直腸癌的鑒別診斷、術前病理分期、預后評估及術后復發轉移評估等方面[10-14]。Smith等[15]使用該系統對結直腸癌患者進行的研究中，發現直腸癌患者經新輔助治療1～2 d后血清蛋白質譜將發生改變，可判定治療效果，敏感率為87.5%，特異性為80%。Zheng等[12]研究發現結直腸癌患者在術后兩周，其血清蛋白質譜發生微小的變化，但這種變化與疾病狀態的具體關系仍舊不明。Christopher等[16]對結直腸癌手術患者術前血液進行檢測，發現病期較晚的患者術前確診為癌的可能性更高。因此認為血清蛋白圖譜能判斷預后，幫助制定輔助治療方案。但這些研究仍傾向于療效的監測和預后評估，并沒有直接對某化療藥物療效進行預測評估。

表1 晚期結直腸癌患者化療受益者(42例)與無效者(28例)蛋白質峰的比較

續上

蛋白質峰(m/z)4304935294044606919839631584．676±827．35343．3679±360．18388．40±465．05333．09±603．851602．84±2232．48702．11±441．07947．1406±506．90174．2481±244．07213．93±378．27175．56±389．99710．29±1786．30500．28±305．920．0007070．0007070．0008060．0012340．0026730．044639

表2 結直腸癌患者化療療效與預測模型的交叉驗證結果

本研究通過對經過一線化療方案治療的晚期結直腸癌患者中受益者與無效者血清蛋白質質譜數據的比較，篩選出10個蛋白質峰，組合構成結直腸癌化療療效預測模型，其總準確率為90.0%(63/70)，靈敏度為90.7%(39/43)。這些蛋白質峰在受益者血清中的表達均高于無效者。表明SELDI-TOF-MS與生物信息學分析相結合的方法，對化療療效的預測的準確率、靈敏度、特異度都較高。

綜上所述，運用SELDI-TOF-MS系統結合生物信息學方法，可以篩選出能預測接受化療的結直腸癌患者療效相關的標志蛋白，建立高靈敏度和特異度的預測模型。因此，該預測模型的建立，為結直腸癌患者進行更好地個體化治療提供了新的方法。但由于本研究樣本量較小，其結果對于臨床的應用價值還有待于通過擴大樣本量及隨訪觀察來進一步的驗證。

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Researchonthebiomarkersforthepredictionofefficacyinfirst-linechemotherapyofmetastaticcolorectalcancerusingSELDI-TOF-MS

SHENHong＊，YUANYing，LIJing-jing，FANGXue-feng，TANChun-wen，YUJie-kai，ZHENGShu.＊DepartmentofMedicaloncology,The2ndAffiliatedHospital,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,China

Correspondingauthor：YUANYing，Email：yuanying1999@zju.edu.cn

ObjectiveTo identify serum protein patterns which could predict the efficacy of first-line chemotherapy of metastatic colorectal cancer(CRC).MethodsSerum from 70 patients diagnosed as metastatic colorectal cancer before first-line chemotherapy were collected and analyzed for protein patterns using ANN analysis of SELDI-TOF-MS.Among the 70 cases,44 patients

FOLFOX regimen,while the other 26 patients received FOLFIRI regimen.After four cycles of the treatment,RECIST criteria were used to define the responders(R)and non-responders(NR).ResultsWith the method of SELDI-TOF-MS，10 protein peaks were identified to be significantly high expressed in 42 responders than in those 28 non-responders.A prediction model was constructed by the combination of these 10 peaks,which could achieve an accuracy of 90.0%(63/70)for the chemotherapy efficiency of CRC patients.ConclusionsThe prediction model combined of 10 protein peaks could be helpful for prediction of the first-line chemotherapy efficiency of metastatic CRC patients.

Biological markers； Colorectal neoplasms; Protein array analysis

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2013.02.05

310009 杭州，浙江大學醫學院附屬第二醫院腫瘤內科(沈虹、袁瑛、李晶晶、房雪峰、譚純文) ；浙江大學腫瘤研究所 惡性腫瘤預警與干預教育部實驗室(余捷凱、鄭樹)

袁瑛，Email：yuanying1999@zju.edu.cn

2012-09-26)

(本文編輯：馬天翼)