愈骨膠囊促進兔骨折愈合的分子機制初探

王 琴，易美彤，曾 敏

(1.重慶市中醫院;2.重慶市中醫院病理科;3.重慶市中醫特色治療工程技術研究中心，重慶 400021)

愈骨膠囊由血竭、骨碎補、續斷、自然銅、元胡等組成，前期藥效學研究結果表明，愈骨膠囊具有消炎止痛，促進鈣鹽沉積和骨折愈合的作用［1-2］。本實驗通過生物力學和病理組織學考察愈骨膠囊對骨折愈合和成骨細胞、膠原纖維以及軟骨形成等的影響，通過免疫組化觀察愈骨膠囊對骨痂組織中轉化生長因子-β(TGF-β)，血管內皮生長因子(VEGF)的影響，探討愈骨膠囊促進骨折愈合的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 愈骨膠囊由重慶市中醫院藥物研究部提供(批號091215);接骨七厘片(湖南金沙制藥股份有限公司，批號100610);依據臨床使用劑量換算出給藥劑量，純化水配制。

1.2 主要儀器和試劑 Instron1011型萬能材料機(美國Instron);OLYMPUS CX31顯微鏡(日本 O-lympus)，Elix3超純水系統(美國 Millipore);HWS24型電熱恒溫水浴箱(上海一恒科學儀器有限公司);硫酸慶大霉素注射液(太極集團西南藥業股份有限公司，批號100701);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號:S1005314);戊巴比妥鈉(上?；瘜W試劑公司，批號:090205)。

1.3 動物實驗 (1)健康雄性新西蘭大耳白兔100只，體質量為(2.5±0.5)kg［購自重慶醫科大學實驗動物中心，合格證號SCXK(渝)2007-0001］。(2)分組及處理:動物分成4組:正常組(10只)、模型組(30只)、愈骨膠囊組(30只)和接骨七厘片組(30只)。除正常組外，實驗兔按30 mg/kg經腹腔注射給予3%戊巴比妥鈉，在麻醉狀態下，采用柴本甫法制備骨折模型［3］。灌胃給藥，愈骨膠囊組劑量為0.138 g/kg，接骨七厘片組劑量為0.115 g/kg，模型組給予等體積純化水。連續給藥2、4、6周后，進行生物力學測定，骨痂組織病理學觀察和免疫組化觀察。圖像用Image-Pro plus 6.0軟件，對陽性反應的平均光密度值(MOD)進行半定量分析［4］。

1.4 統計學方法 實驗數據使用SPSS 17.0軟件進行統計分析，統計結果以表示，各組間的比較采用單因素方差分析ANOVA基礎上的LSD-t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 愈骨膠囊對骨折橈骨的生物力學影響 三點彎曲實驗結果見表1～3。結果表明:在各時相點，與正常組相比，模型組的最大載荷，最大位移和彈性模數均有統計學差異(P＜0.05);在第2周，愈骨膠囊組的最大位移和彈性模數與模型組相比，有統計學差異(P＜0.05);在第4、第6周，愈骨膠囊組的最大載荷，最大位移和彈性模數與模型組相比，有統計學差異(P＜0.05)。與接骨七厘片組相比，在各時相點，愈骨膠囊組的最大載荷，最大位移和彈性模數均無統計學差異。

表1 愈骨膠囊對兔橈骨骨折后最大載荷的影響(N)(，n=5)Tab.1 Effect of Yugu Capsules on maximum load of rabbits with radius fracture(N)(，n=5)

表1 愈骨膠囊對兔橈骨骨折后最大載荷的影響(N)(，n=5)Tab.1 Effect of Yugu Capsules on maximum load of rabbits with radius fracture(N)(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 2周 4周 6周156.03±18.19 156.03±18.19 156.03±18.19模型組 44.28±7.53* 47.40±6.78* 52.84±12.02*接骨七厘片組 51.16±6.33* 76.90±11.50*# 103.32±14.28#愈骨膠囊組 50.98±6.71* 79.09±11.34*# 112.25±18.61正常組#

表2 愈骨膠囊對兔橈骨骨折后最大位移的影響(mm)(，n=5)Tab.2 Effect of Yugu Capsules on maximum displacement of rabbits with radius fracture(mm)(，n=5)

表2 愈骨膠囊對兔橈骨骨折后最大位移的影響(mm)(，n=5)Tab.2 Effect of Yugu Capsules on maximum displacement of rabbits with radius fracture(mm)(，n=5)

分 組 2周 4周 6周3.17±0.48 3.17±0.48 3.17±0.48模型組 1.03±0.22* 1.19±0.29* 1.32±0.28*接骨七厘片組 1.84±0.40*#2.19±0.36*# 2.62±0.32#愈骨膠囊組 1.80±0.38*#2.23±0.42*# 2.71±0.35正常組#

表3 愈骨膠囊對兔橈骨骨折后彈性模數的影響(MPa)(，n=5)Tab.3 Effect of Yugu Capsules on elastic modulus of rabbits with radius fracture(MPa)(，n=5)

表3 愈骨膠囊對兔橈骨骨折后彈性模數的影響(MPa)(，n=5)Tab.3 Effect of Yugu Capsules on elastic modulus of rabbits with radius fracture(MPa)(，n=5)

分 組 2周 4周 6周正常組 2781.21±413.28 2781.21±413.28 2781.21±413.28模型組 756.64±137.68* 867.78±108.12* 1003.72±168.14*接骨七厘片組 1337.68±341.67*#1639.60±328.30*# 2197.10±411.58*#愈骨膠囊組 1427.73±329.34*#1808.13±402.76*# 2217.07±443.64*#

2.2 愈骨膠囊對骨痂病理組織的影響 骨痂病理組織的HE染色結果表明:正常組的骨組織排列整齊，染色均勻;在實驗第2周，模型組骨折間隙成纖維細胞增生明顯，接骨七厘片組骨折間隙內軟骨島和編織骨形成，愈骨膠囊組骨折間隙可見纖維性骨痂和軟骨島形成;在實驗第4周，模型組可見軟骨島與較多新骨形成，部分形成編織骨，接骨七厘片組骨折間隙被新骨充填，編織骨完全形成，愈骨膠囊組編織骨完全形成，且可見板層骨出現;在實驗第6周，愈骨膠囊組骨斷端由重塑的板層骨連接，髓腔貫通;接骨七厘片組髓腔貫通，板層骨欠成熟，而模型組部分板層骨形成。

Masson染色結果表明:與正常組相比，模型組在各觀察時相點的光密度(MOD)值增強，有統計學差異(P＜0.05);與模型組相比，愈骨膠囊組在實驗第2、4周時，MOD值增強，有統計學差異(P＜0.05)，見表4，圖1。甲苯胺蘭染色結果表明:與正常組相比，在各觀察時相點，模型組MOD值增加，有統計學差異(P＜0.05);與模型組相比，愈骨膠囊組第4周時的MOD值增加，有統計學差異(P＜0.05)，見表5，圖2。

表4 愈骨膠囊對骨痂組織膠原纖維光密度的影響(，n=5)Tab.4 Effect of Yugu Capsules on collagen fiber in callus(，n=5)

表4 愈骨膠囊對骨痂組織膠原纖維光密度的影響(，n=5)Tab.4 Effect of Yugu Capsules on collagen fiber in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 第2周 第4周 第6周0.0043±0.0007 0.0043±0.0007 0.0043±0.0007模型組 0.0157±0.0009* 0.1161±0.0102* 0.3031±0.0251*接骨七厘片組 0.0413±0.0045# 0.1452±0.0078 0.3326±0.0255愈骨膠囊組 0.0430±0.0060# 0.4679±0.0340#正常組0.2434±0.0380

圖1 骨痂組織染色照片(Masson，10×10)Fig.1 Pathological tissue section photographs of callus(Masson，10×10)

表5 愈骨膠囊對骨痂組織軟骨光密度的影響(，n=5)Tab.5 Effect of Yugu Capsules on cartilage in callus(，n=5)

表5 愈骨膠囊對骨痂組織軟骨光密度的影響(，n=5)Tab.5 Effect of Yugu Capsules on cartilage in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 2周 4周 6周正常組0.0053±0.0010 0.0053±0.0010 0.0053±0.0010模型組 0.1342±0.0050* 0.2200±0.0292* 0.1884±0.0083*接骨七厘片組 0.2340±0.0276# 0.3042±0.0240 0.0165±0.0030#愈骨膠囊組 0.2266±0.0272 0.3457±0.0393#0.1264±0.0173

圖2 骨痂組織染色照片(甲苯胺蘭，10×10)Fig.2 Pathological tissue section photographs of callus(methylaniline blue，10×10)

2.3 愈骨膠囊對骨痂中TGF-β和VEGF的影響免疫組化結果表明，與正常組相比，模型組中TGF-β和VEGF表達均在第2周時增強，有統計學差異(P＜0.05)，隨后減弱;與模型組相比，愈骨膠囊組中TGF-β和VEGF表達均呈現先增強后減弱的趨勢，在第4周時有統計學差異(P＜0.05)，見表6，圖3，表7，圖4。

3 討論

采用HE、Masson、甲苯胺藍3種染色方法相結合，能從形態學上直觀的了解骨折后骨演變及膠原與新骨生長情況［5-6］。實驗結果表明，愈骨膠囊組軟骨細胞增生明顯、數目較多，軟骨骨痂形成較早，鈣化提前，纖維性骨痂、軟骨島、編織骨及皮質骨出現均較模型組早，骨折端塑形改造良好，髓腔再通時間縮短。生物力學測定結果也表明，愈骨膠囊能增加兔橈骨骨折后的最大載荷，最大位移和彈性模數。

表6 愈骨膠囊對骨痂TGF-β表達光密度的影響(，n=5)Tab.6 Effect of Yugu Capsules on expression of TGF-β in callus(，n=5)

表6 愈骨膠囊對骨痂TGF-β表達光密度的影響(，n=5)Tab.6 Effect of Yugu Capsules on expression of TGF-β in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 2周 4周 6周正常組0.0373±0.0028 0.0373±0.0028 0.0373±0.0028模型組 0.0455±0.0030* 0.0413±0.0034 0.0405±0.0036接骨七厘片組 0.0403±0.0054# 0.0573±0.0040# 0.0506±0.0032#愈骨膠囊組 0.0412±0.0014 0.0649±0.0036# 0.0487±0.0042#

圖3 骨痂組織的TGF-β表達情況(10×10)Fig.3 Expression of TGF-β in callus(10×10)

表7 愈骨膠囊對骨痂VEGF表達光密度的影響(，n=5)Tab.7 Effect of Yugu Capsules on expression of VEGF in callus(，n=5)

表7 愈骨膠囊對骨痂VEGF表達光密度的影響(，n=5)Tab.7 Effect of Yugu Capsules on expression of VEGF in callus(，n=5)

注:與正常組相比，*P＜0.05;與模型組相比，#P＜0.05

分 組 第2周 第4周 第6周正常組0.0398±0.0041 0.0398±0.0041 0.0398±0.0041模型組 0.0621±0.0065* 0.0582±0.0026* 0.0536±0.0044*接骨七厘片組 0.0522±0.0026# 0.0939±0.0140# 0.0566±0.0052愈骨膠囊組 0.0507±0.0026# 0.0823±0.0076#0.0504±0.0027

圖4 骨痂組織的VEGF表達情況(10×10)Fig.4 Expression of VEGF in callus(10×10)

文獻報道，局部的血液供應是影響骨折愈合的最根本因素，一切影響血液供應的因素都會影響骨折愈合，而血管的形成在骨折愈合中起著重要的新生作用，也是支持成骨細胞成骨所必需［7-8］。TGF-β有誘導和增強骨形成的作用，可促進成纖維細胞和成骨細胞外基質的合成，并對新合成基質的降解具有顯著的抑制作用，還能增加血管的形成［9-10］。VEGF具有增加微血管通透性，特異性地與血管內皮細胞受體結合，促進血管內皮細胞分裂和增殖，進而導致新生血管生成等生物學特性，是最有力的血管生成因子，其他血管生成因子的血管生成作用全部或部分通過增強VEGF的表達及生成作用來實現［11-12］;VEGF也可以促進軟骨骨痂向骨性骨痂轉化的過程［13］。與模型組相比，愈骨膠囊能增強骨痂組織內TGF-β和VEGF表達，且在第4周時作用最強。推測愈骨膠囊促進骨折愈合的機制可能與增強骨折前、中期骨痂組織中TGF-β和VEGF表達，從而完善骨痂內微血管重建，加快骨折斷端塑形過程有關。

研究愈骨膠囊對TGF-β和VEGF蛋白表達的影響，有利于探討愈骨膠囊促進骨折愈合的可能機制。但是，參與骨形成與修復過程中的重要細胞因子還包括骨形態發生蛋白(BMP)，成纖維細胞因子(FGF)，血小板衍生生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子(IGF)等［14-15］。因此，在以后研究中有必要對愈骨膠囊促進骨折愈合的分子機制進行全面深入研究，為愈骨膠囊研發提供實驗依據。

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