創傷合并γ射線照射后大鼠脾臟Treg/Th17平衡的變化及其意義

蔡金玲，杜麗，馬瓊，潘秀頡，楊曉云，肖鳳君，崔玉芳

放射損傷復合創傷即放創復合傷(combined wound and radiation，CWR)多見于手術聯合放射治療、核事故以及戰時核爆炸等情況，是難愈性創傷的代表性傷類。創面愈合延遲是此類創傷的顯著特點，但其難愈機制尚未完全闡明。創傷后機體會產生過多炎性因子，且Th1/Th2平衡向Th2偏移，進而出現過度炎性反應和(或)免疫抑制狀態[1]。已知脾臟等免疫組織對電離輻射具有高度敏感性，受到急性輻射損傷后可引起免疫功能受抑，嚴重影響機體功能恢復[2]。調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)/輔助性T細胞17(T helper 17 cells，Th17)平衡與多種疾病(如移植免疫、腫瘤免疫及自身免疫性疾病等)的發生發展密切相關[3-5]，在維持機體免疫內環境穩態方面起重要作用，是現代免疫學關注的重點之一，然而其在放創復合傷中的變化及與傷口愈合的關系目前尚未見報道。據此，本實驗觀察了創傷合并5Gy ?射線全身照射大鼠脾臟Treg細胞和Th17細胞的變化以及Treg/Th17平衡的改變，以期從免疫學角度探索放創復合傷的難愈機制并為該類傷病的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及動物模型制備 清潔級雌性成年Wistar大鼠65只，體重200±20g，購于軍事醫學科學院實驗動物中心。按體重隨機分為正常對照組(正常組，n=5)、單純創傷組(單傷組，n=30)和創傷+5Gy ?射線全身照射組(傷照組，n=30)。大鼠經1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，備皮、局部消毒后，在背部胸段制備直徑1.5cm圓形傷口2個，傷口間隔1.5cm，與脊柱平行，對稱于兩側，深達皮下組織全層。

1.2 照射方式和劑量 傷照組大鼠在致傷后裝入特制的有機玻璃盒內，采用軍事醫學科學院60Co ?射線源一次性全身照射5Gy，源靶距4m，吸收劑量率為160.02cGy/min，正常組和單傷組行假照射。傷照后大鼠單籠飼養于清潔級動物房。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 傷口殘留面積百分比 將傷照后1、3、7、14、21、28d時間點描記的傷口圖像掃描輸入Quantimet 970型自動圖像分析儀(Cambridge公司，英國)進行面積分析[6]。以致傷時的傷口面積作為原面積，各時間點描記的傷口面積為傷口殘留面積，計算傷口殘留面積百分比(傷口殘留面積/原傷口面積×100%)。

1.3.2 外周血白細胞及淋巴細胞計數 傷照后1、3、7、14、21、28d每組各取5只大鼠，留取尾靜脈血，用日本F800型血細胞自動分析儀檢測外周血白細胞及淋巴細胞計數。

1.3.3 Treg細胞亞群分析 傷照后1、3、7、14、21、28d每組各取5只大鼠，取脾臟冰浴制成細胞懸液(2×106/L)，裂解紅細胞，洗滌后加入適量抗大鼠CD4 FITC和CD25 APC抗體(eBioscience公司)，4℃孵育30min；洗滌后每管加入1ml新鮮配制的固定液，4℃避光孵育30min；破膜后加入抗大鼠Foxp3 PE抗體(eBioscience公司)，4℃避光孵育30min；洗滌重懸后，采用流式細胞儀(BD Calibur，美國BD公司)檢測Treg細胞比例，結果采用FlowJo軟件進行分析。

1.3.4 Th17細胞亞群分析 傷照后1、3、7、14、21、28d每組各取5只大鼠，取脾臟冰浴制成細胞懸液，紅細胞裂解后用含10%胎牛血清的RPMI 1640調整細胞濃度至2×106/ml，然后接種于24孔板，每孔1ml，同時加入刺激劑和蛋白質轉運抑制劑復合物(2μl/孔)，置于37℃、5% CO2孵箱中培養5h；PBS洗滌后加入適量抗大鼠CD4 FITC抗體(eBioscience公司)4℃孵育30min；固定、破膜后加入抗小鼠IL-17A PE抗體(eBioscience公司)，室溫避光孵育30min；洗滌重懸后，采用流式細胞儀(BD Calibur，美國BD公司)檢測Th17細胞比例，結果采用FlowJo軟件進行分析。

1.4 統計學處理 數據結果以x±s表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進行方差分析，進一步兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 傷口殘留面積百分比 傷口殘留面積百分比與傷口愈合速度成反比，傷口殘留面積百分比越大，表明傷口愈合速度越慢。傷照后1～3d傷照組傷口殘留面積百分比與單傷組比較差異無統計學意義，而7～14d時明顯高于單傷組(P＜0.01)，21d時單傷組傷口已基本愈合，而傷照組延遲至28d時才基本愈合(表1)。

表1 傷照后不同時間大鼠傷口殘留面積百分比(%，，n=5)Tab. 1 Percentage of residual wound area of rats at different time points after exposure to combined wound and radiation(%, x±s, n=5)

表1 傷照后不同時間大鼠傷口殘留面積百分比(%，，n=5)Tab. 1 Percentage of residual wound area of rats at different time points after exposure to combined wound and radiation(%, x±s, n=5)

Group 1d 3d 7d 14d 21d 28d MW 86.5±5.874.9±6.3 26.5±4.4 2.0±0.4 0 0 RW 86.2±5.874.8±4.1 39.8±3.0(1)3.5±0.8(1)2.5±0.4 0 MW. Wound only group; RW. Wound plus 5Gy whole body γ-radiation group; (1)P＜0.01 compared with MW group

2.2 外周血白細胞及淋巴細胞的變化 單傷組大鼠外周血白細胞及淋巴細胞計數在傷照后1～7d明顯低于正常組，14～28d時與正常組比較差異無統計學意義。傷照組大鼠白細胞及淋巴細胞計數在傷照后1～14d明顯低于正常組和單傷組，21～28d時白細胞計數仍明顯低于正常組和單傷組，而淋巴細胞計數與單傷組比較未見明顯差異，但仍明顯低于正常組(圖1)。

2.3 大鼠脾臟Treg細胞及Th17細胞的變化 傷照后各時間點單傷組大鼠脾臟Treg細胞及Th17細胞比例與正常組比較未見明顯差異。傷照組Treg細胞比例僅在照后3d和7d高于正常組和單傷組(P＜0.01)，而Th17細胞于傷照后1d即顯著增高(P＜0.01)，3d時升至最高，7～21d時仍顯著高于正常組和單傷組，至28d才恢復至正常組和單傷組水平(圖2)。

圖1 傷照后不同時間大鼠外周血白細胞(A)及淋巴細胞(B)計數比較Fig. 1 Changes of peripheral white blood cell (A) and lymphocyte (B) counts in rats after exposure to combined wound and radiation

2.4 大鼠脾臟Treg/Th17比值的變化 傷照后各時間點單傷組大鼠脾臟Treg/Th17比值與正常組比較未見明顯差異。傷照組大鼠Treg/Th17比值于傷照后1d即迅速降低(P＜0.01)，3d降至最低，直至21d時仍明顯低于正常組和單傷組，28d時恢復至正常水平(圖3)。

圖2 傷照后不同時間大鼠脾臟Treg細胞(A)和Th17細胞(B)比例的變化Fig. 2 Changes of splenic Treg (A) and Th17 (B) percentages in rats after exposure to combined wound and radiation

圖3 傷照后不同時間大鼠脾臟Treg/Th17 比值的變化Fig. 3 Changes of splenic Treg/Th17 ratio in rats after combined wound and radiation

3 討 論

創傷合并放射損傷后使創傷和放射損傷均加重，其創傷愈合過程也變得更為復雜。因此，放創復合傷不僅是創傷醫學和放射醫學重點關注的課題，也是臨床救治的難題。雖然目前關于難愈性創傷的機制已有大量報道，但從整體免疫調節方面進行研究的報道較少。據此，本實驗觀察了創傷大鼠合并5Gy ?射線全身照射后Treg/Th17平衡的變化特點，期望能從免疫學角度為放創復合傷深層次損傷機制的研究提供依據。

本研究對傷口殘留面積進行定量分析發現，5Gy全身照射后傷口愈合明顯延遲，與單傷組比較延遲約1周，而傷照組外周血白細胞計數也一直處于較低水平，與以往實驗結果一致[6]，表明本實驗建立的模型是成功的。Treg細胞是具有免疫抑制活性的T細胞亞群，其最主要的生物學功能是調節抗炎和致炎T細胞之間的平衡，它的免疫活性決定著炎癥的方向和轉歸。Ni Choileain等[7]研究顯示，燒傷后7d小鼠淋巴結中Treg細胞活性明顯增加；Huang等[8]研究發現，嚴重燒傷患者外周血中Treg細胞明顯增加，而且Treg細胞分泌的TGF-β和IL-10也顯著增多。提示燒傷誘發的Treg活性和功能增強，可能有助于拮抗創傷后過度炎癥反應的發生。本課題組前期觀察到經6Gy ?射線照射后，小鼠脾臟等免疫組織Treg細胞比例明顯增加[9-10]，外周血IL-10和TGF-β抑制性細胞因子含量明顯增高[10]。本實驗結果顯示，與正常組比較，單傷組脾臟中Treg細胞未見明顯變化，而傷照后3～7d，傷照組大鼠脾臟中Treg細胞則顯著高于正常組和單傷組。上述結果提示，輻射可導致Treg細胞比例增加，引起免疫調節異常，這可能是創傷愈合延遲的重要原因之一。

Th17細胞是近年發現的一種不同于Th1和Th2的CD4+效應性T細胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎因子。Th17可通過直接和間接作用引起炎性細胞浸潤及組織損傷，因此在感染或損傷早期的炎癥反應中具有至關重要的作用。Sasaki等[11]研究發現，燒傷后3h即可在小鼠燒傷皮膚組織中檢測到高水平的IL-17和IL-22，Neely等[12]也發現燒傷后小鼠創面引流淋巴結中Th17比例及數量均顯著增高，表明Th17參與了創傷局部早期的炎癥反應。本實驗結果顯示，傷照組大鼠脾細胞中Th17顯著高于單傷組。由于Th17急劇升高，導致大鼠脾臟Treg/Th17比值在傷照后的1～21d持續降低，出現Treg/Th17平衡模式向Th17反應漂移的現象。Treg與Th17在分化和功能上互相對抗，Treg/Th17平衡模式對維持機體免疫內環境穩定具有至關重要的作用，一旦平衡失調，可引起全身或局部免疫應答異常。

綜上所述，本研究結果提示創傷合并輻射損傷后Treg/Th17平衡模式向Th17免疫反應漂移，致使機體持續處于以過度炎癥反應為主的免疫紊亂狀態，進而影響局部創傷的修復，這很可能是輻射導致創傷難愈的深層次免疫學機制之一。

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