?；撬嵩诖笫篌w內(nèi)的藥代動力學(xué)

趙宏濤，黎云燕

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，天津 300211；2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070）

?；撬幔═aurine，TAU）化學(xué)名為2-氨基乙磺酸或β-氨基乙磺酸，分子式為C2H2NO3S，是存在于動物以及人體內(nèi)的一種非蛋白質(zhì)的游離氨基酸[1]，尤其在海洋生物中含量最高，主要從腎臟排泄，它具有廣泛的生理藥理作用[2]，能調(diào)節(jié)機體的糖代謝和脂代謝[3]，具有細胞保護、抗心律失常、抗高血壓[4]和抗動脈粥樣硬化、保護心肌、抗心力衰竭、改善學(xué)習(xí)記憶能力[5]、改善視覺信號傳導(dǎo)、增強免疫力等作用，是人類條件必需氨基酸。體內(nèi)缺乏TAU 會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，補充TAU 對這些疾病將起到積極的防治作用。目前對于牛磺酸測定應(yīng)用最廣泛的是HPLC 法，該方法精密度、靈敏度均較高，對于生物樣本中牛磺酸的測定非常適合。通過查閱文獻，?；撬岬腍PLC 測定基本采取柱前或柱后衍生的方法[6-9]，涉及檢測器包括紫外（UV）檢測器、熒光（FL）檢測器，電化學(xué)（EC）檢測器等。國外的資料中報道測定?；撬岬姆椒ㄓ袣庀嗌V法、氣相-質(zhì)譜法、離子交換色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等。本文建立了柱前衍生的HPLC 法測定血漿中?；撬岷?，對牛磺酸進行了臨床前的藥代動力學(xué)研究，對?；撬嵩诖笫篌w內(nèi)的藥-時過程進行初步探討，目的在于揭示藥物在大鼠體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，獲得基本的藥代動力學(xué)參數(shù)，闡明藥物的吸收和分布的過程和特點，為?；撬峤窈蟮难芯康於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心提供，合格證號：0000691。

1.1.2 藥品與試劑 牛磺酸（純度＞99%，Sigma 公司）；2，4－二硝基氟苯（DNFB）（日本東京化成工業(yè)株式會社）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；重蒸水自制；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀，紫外檢測器，G1379A 在線脫氣機，G1311A 四元泵，G1329A自動進樣器。G1316A 柱溫箱（美國安捷倫科技有限公司）；分析天平AB135-S（METTLER TOLEDO，瑞士）。TGL-16G 離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠，中國）。

1.2 方法

1.2.1 液體配制（1）流動相A：稱取無水乙酸鈉4.1 g，加水至1 000 mL，濃度為0.05 mol/L，加入乙酸40μL，pH為7.0。（2）流動相B：量取乙腈400 mL，加入雙蒸水600 mL，超聲除氣20 min，配成乙腈－水（40∶60）溶液。（3）磷酸鹽緩沖溶液：稱取KH2PO46.8 g，加0.1 mol/L NaOH 291 mL，加水至1 000 mL，pH7.0。（4）?；撬醿湟海簻蚀_稱取牛磺酸對照品40 mg，置于10 mL 量瓶中，加水定容，配置成濃度為4 mg/mL 的牛磺酸對照品儲備液。（5）DNFB 衍生試劑：取DNFB 250μL 置于25 mL 棕色量瓶中，乙腈定容，濃度為1%，置4℃冰箱避光保存。（6）肝素鈉溶液：取肝素鈉1 支（2 mL：1.25 萬U），用0.9%氯化鈉稀釋至10 mL，配成1%溶液，置4℃冰箱保存，用于肝素化試管。

1.2.2 血漿制備 取Wistar 大鼠，分為低（40 mg/kg）、中（80 mg/kg）、高（160 mg/kg）3個劑量組，每組18只，實驗前24 h 及實驗期間禁食，自由飲水，稱重，清醒狀態(tài)下自尾靜脈注射TAU，分別于給藥前和給藥后1、3、5、10、15、20、30、45 min，1、1.5、2 h，從內(nèi)眥靜脈取血0.5 mL，4 000 r/min 離心10 min，分離血漿。-20℃冰箱儲存，測定時取出。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A：0.05 mol/L 乙酸鈉溶液（pH7.0），B：乙腈-水（40∶60，v/v）；流速：1.0 mL/min；洗脫梯度：0.10 min（流動相A：80%，流動相B：20%）-5.0 min（流動相A：40%，流動相B：60%）-5.01 min（流動相A：40%，流動相B：60%）-15.0 min（流動相A：80%，流動相B：20%）-20.0 min（流動相A：80%，流動相B：20%）；檢測波長：360 nm；柱溫：40℃；進樣量：20μL。

1.2.4 血漿樣品處理 取大鼠血漿200μL，加入乙腈200μL，渦旋混勻，4 000 r/min 離心10 min，取上清液300μL 于5 mL 量瓶中，加入NaHCO3300μL，1%DNFB 200μL，置于60℃避光水浴1 h，加磷酸鹽緩沖液至量瓶刻度，經(jīng)微孔濾膜過濾后進樣測定。

1.2.5 標準曲線制備 取?；撬峁ぷ饕?0μL，加入大鼠空白血漿200μL，制備成濃度為800、400、200、100、50、25、12、6.0、3.0μg/mL的血漿標準溶液，加入乙腈160μL，其余按“1.2.4 血漿樣品處理”項下操作，同時取同一大鼠空白血漿200μL，按“1.2.4 血漿樣品處理”項下操作，以血漿樣品濃度為橫坐標，各濃度扣除動物空白血漿藥物的峰面積所得的數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸分析。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 方法的專屬性 以?；撬針藴嗜芤哼M樣，得到色譜圖1，保留時間為11.5 min，大鼠禁食24 h后，在未給藥情況下取空白血漿，應(yīng)用血漿樣本的預(yù)處理方法進行操作后進樣，得到色譜圖2，同時采集大鼠給藥后血漿，同樣方法進行預(yù)處理后進樣得到色譜圖3。以上結(jié)果進行比較后可知：在本實驗分析條件下，標準溶液有良好的峰形，與衍生劑峰分離良好；大鼠空白血漿牛磺酸出峰位置有穩(wěn)定的基礎(chǔ)值，可采取將其扣除的方法來計算血漿以及組織臟器中藥物濃度，其余內(nèi)源物質(zhì)對樣品測定無干擾。

1.3.2 標準曲線及線性關(guān)系 在3.0～800μg/mL 濃度范圍內(nèi)，藥物濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 批內(nèi)、批間差異試驗 低、中、高3 種不同濃度的?；撬嵫獫{樣品每日內(nèi)進樣6 次，連續(xù)3 d，測定其峰面積，計算出批內(nèi)、批間差異。批內(nèi)RSD 分別為11.6%、10.5%、4.0%，批間RSD 分別為8.4%、2.9%、9.8%。

1.3.4 衍生化后樣品室溫保存穩(wěn)定性 樣品衍生化后在室溫放置0、10、20 h 后分別測定，6、50 和400μg/mL 3個濃度RSD 分別為7.3%、2.2%、2.8%，表明?；撬嵫苌髽悠吩谑覝胤胖?0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.5 血漿樣品-20℃儲存穩(wěn)定性 取6.25、50 和400μg/mL 3個濃度血漿樣品，分別于-20℃冰箱放置0、30、61 d 后進行樣品衍生化處理上機測定，RSD 分別為9.1%、2.0%、8.2%，表明樣品在-20℃冰箱儲存61 d 穩(wěn)定性良好，可以用于大鼠樣品儲存。

1.3.6 加樣回收率試驗 向已知濃度的血漿樣品中，分別加入低、中、高3 種不同濃度的?；撬針藴势?，按“1.2.3”項下條件進樣測定,扣除樣品中原有的?；撬岷?，計算出加樣回收率，平均回收率分別為95.2%（n＝6），見表1。

表1 ?；撬嵫獫{樣品回收率（±s，n=6）

表1 牛磺酸血漿樣品回收率（±s，n=6）

2 結(jié)果

2.1 血漿樣品測定結(jié)果 大鼠以各劑量給藥后，血藥濃度測定結(jié)果見表2。

表2 靜脈注射牛磺酸后大鼠血漿?；撬釢舛龋ā纒，n=6）

表2 靜脈注射牛磺酸后大鼠血漿牛磺酸濃度（±s，n=6）

2.2 主要藥代動力學(xué)參數(shù)計算 應(yīng)用藥代動力學(xué)分析軟件（3P97）對藥物血漿濃度-時間數(shù)據(jù)進行自動程序擬合，經(jīng)AIC、F 檢驗綜合判斷，選擇權(quán)重為1/C2進行計算，所得結(jié)果表明，在本實驗的濃度范圍內(nèi)，TAU 在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)行為基本符合一房室模型。各組實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件以O(shè)ne-Way ANOVA 方法進行組間均值比較，其藥代動力學(xué)參數(shù)分別見表3，由表中數(shù)據(jù)可知：各劑量組藥物濃度-時間曲線并不符合線性動力學(xué)呈直線的特征；TAU 在大鼠體內(nèi)的消除半衰期隨著給藥劑量的增加而增加，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），AUC 與劑量有一定相關(guān)性（r=0.981 3），關(guān)于Cls 則低劑量與中劑量無統(tǒng)計學(xué)差異，與高劑量組則有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。

表3 大鼠靜脈注射?；撬岷笾饕幋鷦恿W(xué)參數(shù)（±s，n=6）

表3 大鼠靜脈注射?；撬岷笾饕幋鷦恿W(xué)參數(shù)（±s，n=6）

AUC為積分法計算數(shù)據(jù)，AUC（0－∞）和AUC（0－t）為梯型法計算數(shù)據(jù)。與低劑量組比*P<0.05，**P<0.01；與高劑量組比△P<0.01

3 討論

近年來由于抗心律失常藥物的廣泛應(yīng)用，治療過程中出現(xiàn)新的或惡化的室性快速型心律失常時有發(fā)生，引起臨床廣泛重視。因此，尋找安全有效的抗心律失常藥物是醫(yī)藥工作者的重要任務(wù)。牛磺酸是存在于人體內(nèi)的一種重要生物活性物質(zhì)，尤以心肌組織最豐。藥代動力學(xué)研究結(jié)果的正確與否在很大程度上與測定的給藥后藥時數(shù)據(jù)準確程度相關(guān)。因此，建立一種準確可靠的生物樣本中藥物測定方法是藥代動力學(xué)研究的重要條件。

3.1 ?；撬釞z測方法的確定 檢測大多數(shù)藥物血漿濃度的常用方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）、液相色譜法（liquid chromatography，LC）和色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS）等。近年來HPLC 技術(shù)理論日趨成熟，并出現(xiàn)自動裝置，使操作更方便而廣泛用于分離藥物、生物等有關(guān)的大分子和離子型化合物，各種天然產(chǎn)物以及各種化工有機物質(zhì)和高分子物質(zhì)。HPLC 法己成為當(dāng)前藥物分析和藥代動力學(xué)研究的一個重要手段。各國藥典的許多藥品都以HPLC 方法作為藥品檢驗標準。目前HPLC 已在藥代動力學(xué)研究領(lǐng)域中確立了主導(dǎo)地位。

由于牛磺酸本身沒有紫外吸收和熒光發(fā)射的特性，須經(jīng)衍生化后方能進行含量測定。牛磺酸測定方法建立過程中最主要的是對于衍生劑的選擇，根據(jù)本實驗室現(xiàn)有條件以及文獻中各衍生化試劑的特點，實驗中主要比較分析了3 種?；撬釡y定中最常用的衍生化試劑：鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde,OPA），異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）和2，4－二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzen，DNFB）。

3.2 ?；撬狍w內(nèi)過程分析 在常規(guī)治療劑量范圍內(nèi)，多數(shù)藥物的體內(nèi)動力學(xué)規(guī)律均屬于線性動力學(xué)過程，其特點是藥物在體內(nèi)的動力學(xué)過程可用線性方程來描述，藥物的消除半衰期、清除率與劑量大小無關(guān)。線性動力學(xué)分析基于以下3 點假設(shè)：（1）藥物分布相對消除而言，其過程是迅速完成的。（2）藥物消除（包括生物轉(zhuǎn)化和排泄）可作為一級速率過程處理。（3）藥物的吸收可作為一級速率過程處理，或因迅速完成而忽略不計。

但是在實踐中并非總是如此，如果一種藥物的動力學(xué)過程不完全符合上述假說，就會偏離線性，從而具有某些非線性動力學(xué)的特點。非線性動力學(xué)的特點可歸納為以下幾點：（1）血藥濃度與給藥劑量不成正比關(guān)系。（2）AUC 與給藥劑量不成正比關(guān)系。（3）消除半衰期（T1/2）隨給藥劑量增加而延長。（4）平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度與給藥劑量不成正比關(guān)系。

大量資料證實，許多藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程都是非線性過程。存在非線性動力學(xué)過程的原因是多方面的，如藥物的生物轉(zhuǎn)化或排泄過程的飽和性、藥物吸收、腎小管分泌和重吸收、腎和膽汁排泄的差別、肝臟藥物代謝酶活性引起的代謝差異以及酶的誘導(dǎo)和抑制引起的代謝差異等，均可引起非線性動力學(xué)過程的出現(xiàn)。在這種情況下，在治療劑量范圍內(nèi)劑量的微小改變會引起藥物血藥穩(wěn)態(tài)濃度的大幅度改變。要解釋和清楚認識藥物的非線性動力學(xué)過程，需要非線性方程。Michaelis-Menten 動力學(xué)方程在非線性藥物動力學(xué)研究中具有重要的意義。

利用本文建立的?；撬酘PLC 檢測方法，筆者研究了3 種不同劑量給藥后TAU 在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點，其中單次靜脈注射劑量分別為40、80 和160 mg/kg 的TAU 后，血漿藥物濃度以中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會編制的實用藥代動力學(xué)程序（3P97）軟件計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果TAU 在大鼠血漿中的藥代動力學(xué)特征符合一房室非線性動力學(xué)過程，依據(jù)如下：（1）TAU 半衰期隨劑量增加而增加，低、中、高3個劑量組TAU 給藥后半衰期分別為20.61、37.36 和77.55 min，采用One-Way ANOVA 進行組間均值比較，3組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異（P<0.01），與一級動力學(xué)半衰期恒定的特點相悖。（2）低、中、高3個劑量組AUC（0-t）分別為10 132.0、18 305.5 和59 508.6μg/（mL·min），隨著給藥劑量的增加，AUC（0－t）未表現(xiàn)出明顯的劑量線性相關(guān)，隨劑量增加，AUC 增加幅度較大。（3）TAU 清除率分別為0.004、0.004 和0.002μg/（mL·min），低劑量和中劑量相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但都與高劑量組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），高劑量組明顯降低，也不符合一級動力學(xué)特點。（4）低、中、高3個劑量組TAU 給 藥 后Ke 分別為0.033 6、0.015 和0.009/min，采用One-Way ANOVA 進行組間均值比較，3組數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異（P<0.05）。從描繪的80 mg/kg 和160 mg/kg組的藥物濃度-時間曲線上可以看出，上端按凸型曲線衰減，下端則為線性衰減，與Michaelis-Menten 動力學(xué)方程特征相似，這也證明TAU 在動物體內(nèi)呈非線性動力學(xué)過程。TAU呈混合速率代謝，這可能與TAU 在肝臟代謝過程中相關(guān)代謝酶類飽和有關(guān)。

本文并沒有直接考察到靜脈注射TAU 后藥物在動物體內(nèi)的線性動力學(xué)過程，分析原因除了動物個體差異外，還可能與選擇的劑量值過高，造成一定的蓄積有關(guān)。另外中、高劑量藥-時曲線下端在較高濃度范圍內(nèi)衰減速度明顯變慢，也提示可能在此劑量注射下有一定的藥物蓄積。本實驗中，大鼠TAU 的給藥劑量是參照本實驗室TAU 藥效學(xué)實驗中有效劑量換算而來，而藥代動力學(xué)試驗結(jié)果顯示劑量偏高，這可能與動物種屬不同存在個體差異等方面原因?qū)е陆o藥劑量偏大有關(guān)。

［1］Musio R,Sciacovelli O.Detection of taurine in biological tissues by 33S NMR spectroscopy[J].J Mag Res,2001,153（2）:259

［2］Parildar-Karpuzogˇlu H,Mehmetcik G,Ozdemirler-Erata G,et al.Effect of taurine treatment on pro-oxidant-antioxidant balance in livers and brains of old rats[J].Pharmacol Rep,2008,60（5）:673

［3］Kim K S,Ji H I,Yang H I.Taurine may not alleviate hyperglycemia -mediated endoplasmic reticulum stress in human adipocytes[J].Adv Exp Med Biol,2013,775:395

［4］Scabora J E,de Lima M C,Lopes A,et al.Impact of taurine supplementation on blood pressure in gestational protein-restricted offspring:Effect on the medial solitary tract nucleus cell numbers,angiotensin receptors,and renal sodium handling [J].J Renin Angiotensin Aldosterone Syst,2013,in press

［5］常小麗，黃慧玲，李曉茜，等.?；撬釋δX創(chuàng)傷大鼠腦組織代謝的影響[J].天津醫(yī)藥，2012,40（5）:493

［6］魏柳珍，韓燕，呂翼.高效液相色譜法測定?；撬犷w粒的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007,27（1）:126

［7］陳瑞瑾.柱前衍生高效液相色譜法測定通絡(luò)下乳口服液中?；撬岬暮縖J].中國民族民間醫(yī)藥，2012,12（4）:56

［8］張玉環(huán)，于廣新，陽忠輝，等.異位性皮炎患者血清?；撬崴降臏y定[J].天津醫(yī)藥，2005，33（12）:765

［9］王曉鶯，孫成均，楊元，等.FMOC 柱前衍生-高效液相色譜法測定飲料中的?；撬醄J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，33（3）:371