高效液相色譜法同時測定醬油中的十種常見添加劑

周運柯，梅玉琴，張 微

(1.自貢市產(chǎn)品商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川 自貢 643000;2.自貢市疾病預(yù)防控制中心，四川 自貢 643000)

食品中的添加劑檢測一直是食品檢測的主要內(nèi)容。近年來，隨著人們食品安全意識的加強，食品中的甜味劑與防腐劑的使用情況日益受到廣大消費者的重視。目前，對醬油中的安賽蜜，苯甲酸，山梨酸，糖精鈉，脫氫乙酸，富馬酸二甲酯和對羥基苯甲酸酯類化合物在GB2760-2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中［1］均有明確的使用要求。并且，國家標(biāo)準(zhǔn)中對這些添加劑都有著相應(yīng)的檢測方法［2-6］，主要為高效液相色譜法［2，5-6］和氣相色譜法［3-4］等。但是絕大多數(shù)方法中都只能檢測幾種添加劑，而且由于檢測中使用的儀器和前處理方法不同，導(dǎo)致各組分檢測要多次進行，不僅增大了工作量和成本，而且不能適應(yīng)多組分物質(zhì)同時檢測的趨勢。已有文獻對醬油中的多種物質(zhì)同時進行了檢測［7-10］，但是樣品需要SPE小柱［7-9］或凝膠色譜［10］凈化，操作繁瑣且實驗成本高。本研究參考相關(guān)文獻［7-9，11-14］，優(yōu)化檢測方法，在現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，采用20%甲醇提取，梯度洗脫，雙波長同時檢測，一次性檢測醬油中的十種添加劑。該方法簡便，靈敏，準(zhǔn)確，快速，可用于對醬油中的添加劑含量進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜(1 mg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，脫氫乙酸、富馬酸二甲酯(99%，美國Chemservice)，對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯(99%，天津博迪化工有限公司)，醋酸銨、亞鐵氰化鉀、1+1鹽酸溶液、乙酸鋅(分析純，重慶川東化工廠)，甲醇(HPLC級，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1200series型液相色譜儀，帶二極管陣列檢測器和自動進樣器(美國安捷倫公司)，H1650R離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 色譜條件

Welch Xtimate C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，粒徑5μm)，柱溫40℃，流速1.5 mL/min，流動相為甲醇(A):0.02 mol/L的醋酸銨溶液(B)。梯度洗脫程序為0～3 min，5%A+95%B;3～5min，A由5%升至20%，保持5 min;10～13 min，A由20%升至60%，保持9 min，22.1 min，A由60%恢復(fù)至5%，保持5 min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸、富馬酸二甲酯、對羥基苯甲酸酯甲酯、乙酯、丙酯和丁酯各0.1000 g，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液濃度為1.000 mg/mL。然后取各種添加劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.25 mL，0.50 mL，0.75 mL，1.00 mL于25 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇，用水定容至刻度，混勻。其濃度依次為0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.03mg/mL，0.04 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)過0.22μm的尼龍濾膜過濾后測定，以峰面積對濃度進行線性回歸。

1.5 樣品前處理

稱取樣品3 g(精確至0.0001 g)于25 mL容量瓶中，加入5 mL水和10 mL甲醇混勻后，依次加入0.5 mL 300 g/L的乙酸鋅溶液和0.5 mL 150 g/L的亞鐵氰化鉀溶液，用水稀釋至刻度，混勻，于離心機上(10 000 r/min)離心5 min，經(jīng)過0.22μm的尼龍濾膜過濾后測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長的選擇

國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻中糖精鈉、苯甲酸、山梨酸的檢測波長為230 nm［1］，安賽蜜的檢測波長為214 nm［4］，脫氫乙酸為254 nm［8］，富馬酸二甲酯為220 nm［5］，對羥基苯甲酸酯為254 nm［7］，而利用DAD檢測器的光譜掃描功能對各種待測物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最大吸收波長在200～800 nm進行掃描后發(fā)現(xiàn)，糖精鈉、苯甲酸山梨酸、安賽蜜、脫氫乙酸、富馬酸二甲酯和對羥基苯甲酸酯的最大吸收波長依次為:206 nm，224 nm，255 nm，227 nm，230 nm，200 nm及254 nm，可以看出，除對羥基苯甲酸酯外，其余組分均在230 nm處有著較大的紫外吸收，為盡可能兼顧目標(biāo)化合物的靈敏度，采用了雙波長檢測的方案，即糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、脫氫乙酸、富馬酸二甲酯采用230 nm的波長進行檢測，而對羥基苯甲酸酯則采用254 nm的波長進行檢測。

2.2 流動相pH的選擇

流動相B配置好并按照設(shè)置條件運行后，脫氫乙酸與山梨酸混合在一起無法分離，而其它組分分離良好(圖1a)，此時測得乙酸銨溶液的pH為7.05，而用1+1的鹽酸溶液對流動相B調(diào)節(jié)pH至5.8后，各組分都能夠得到良好的分離(圖1b)。推測是由于在低pH條件下，脫氫乙酸與山梨酸的存在狀態(tài)與固定相和流動相的相互作用各不相同而導(dǎo)致二者分離。

圖1 不同pH流動相條件下230 nm波長色譜圖

2.3 提取溶劑的選擇

取一定量的樣品，分別加入不同量的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、富馬酸二甲酯及四種對羥基苯甲酸酯類物質(zhì)，依次采用水，10%甲醇，20%甲醇，40%的甲醇溶液對醬油中的待測物進行提取，按照上述方法處理后，平行測定3次，計算其回收率，其結(jié)果見表1。從表1可以看出，用20%的甲醇與40%的甲醇作為提取溶劑均對各類待測物有著良好的回收，但是用40%的甲醇作為提取溶劑時，安賽蜜的峰型嚴(yán)重變矮拖尾，影響實際測定，因此綜合考慮后使用20%的甲醇作為提取溶劑，10種待測物的回收率均在94.8%～101.0%范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的回收率。

2.4 線性范圍及檢出限

在選定實驗條件下，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程和線性范圍。按照信噪比(S/N)等于3計算最低檢測濃度。按實驗方法對實際樣品加入200 mg/kg的10種待測物的混合標(biāo)液，平行測定6次，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，該方法對各種待測物具有較寬的線性范圍和較高的精密度及相關(guān)系數(shù)。

2.5 樣品測定結(jié)果

采用此方法，對自貢市轄區(qū)范圍內(nèi)的企業(yè)生產(chǎn)的5種醬油進行了檢測，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，5種醬油中有4種醬油檢出了苯甲酸，1種醬油檢出了山梨酸，還有一種醬油檢出了安賽蜜。其含量范圍在0.02～0.81 g/kg之間，均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［1］的要求。圖2為其中一份醬油樣品的色譜圖及其加標(biāo)色譜圖。

表1 醬油中10種添加劑在不同提取溶劑中的回收率

表2 10種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、檢出限及標(biāo)準(zhǔn)偏差

表3 樣品測定結(jié)果

圖2 醬油樣品色譜圖

3 結(jié)束語

應(yīng)用此方法對醬油中的10種添加劑進行檢測，各個待檢組分在具有良好分離度的同時還擁有較高的精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度，相對于文獻的方法［2-13］，操作簡便、快速且成本較低，符合相應(yīng)的檢測要求，可以作為一次性檢測醬油中多種添加劑的高通量檢測方法，對適應(yīng)食品中多組分同時檢測的需求和趨勢具有積極的作用。

［1］GB 2760-2011，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］GB/T 23495-2003，食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定［S］.

［3］GB/T 5009.31-2003，食品中對羥基苯甲酸酯類的測定［S］.

［4］GB/T 5009.121-2003，食品中脫氫乙酸的測定［S］.

［5］GB/T 5009.140-2003，食品中乙酰胺磺酸鉀的測定［S］.

［6］NY/T 1723-2009，食品中富馬酸二甲酯的測定［S］.

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［8］楊紅梅，劉艷琴，王 浩，等.固相萃取-高效液相色譜法測定醬油中10種防腐劑［J］.中國調(diào)味品，2011，36(5)：94-100.

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