酒醅微生物DNA提取預處理方法研究

沈才萍，李德林，沈才洪，3，鄧 波，3，沈小娟，3，敖宗華，，3

(1.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000;2.四川理工學院生物工程學院，四川 自貢 643000;3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000)

引言

運用分子生物學相關方法對固態釀造食品中微生物進行分子生態分析。不僅能克服經典培養方法對微生物群落結構特征信息研究丟失的局限，還可以更加可靠、快速地獲得發酵過程中各種微生物的菌落指紋特征，確定微生物的多樣性及其分類地位。對食品發酵進行微生物分子生態研究，首先是需要獲得高質量微生物總DNA。所以，發酵食品微生物總DNA提取是進行后續分子生物學研究的第一個技術難點。能否快速成功獲得樣品的總DNA，獲得的總DNA質量的高低直接影響整個后續實驗的成敗［1］。在富含多糖、鹽、淀粉、腐殖酸和代謝色素酚等雜質的酒醅環境中提取微生物總DNA，這些雜質不易與DNA樣品分離，而它們的存在會抑制DNA聚合酶活性，導致后續分子生物學實驗失敗。

環境樣品總DNA預處理方法可概括為兩類:直接法和間接法，直接法是先用溶液溶解樣品中的雜質，通過反復離心等方法獲得樣品沉淀，該操作能除去環境樣品中水溶性雜質，還能減少微生物在預處理中的丟失;間接法提取是通過梯度離心、離心洗滌等步驟出去樣品雜質，然后再收集菌體，該過程容易造成微生物種類和數量的丟失，但能夠得到較高質量的DNA。根據環境樣品的差異采用合適的預處理方法，能夠保證實驗的順利進行。在此，本實驗研究了不同預處理方法，以獲得一種適合酒醅環境中微生物總DNA提取預處理的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酒醅樣品采集于瀘州老窖羅漢基地濃香型白酒窖池。取樣后迅速置于-80℃冰箱保藏，備用。

1.2 主要試劑與儀器

試劑:蛋白酶k(上海生工生物工程技術服務有限公司)、無菌水、TENP緩沖液、PBS緩沖液。

儀器:PCR儀(美國BIORAD)、DGGE電泳儀(美國BIORAD)、高速離心機(日本HITICHI)、核酸蛋白檢測儀(德國Eppendorf)。

1.3 酒醅預處理

稱取0.5 g酒醅樣品于50 mL離心管，分別按照下面方法進行。

方法A(無菌水):離心管加入3 mL無菌水和0.3 g玻璃珠，漩渦震蕩5 min，10 000 rpm離心5 min，棄上清。在沉淀中加入3 mL無菌水重復上述操作2次，取沉淀。

方法B(TENP):離心管加入3mL TENP緩沖液和0.3 g玻璃珠，漩渦震蕩5 min，10 000 rpm離心5 min，棄上清。在沉淀中加入3mL TENP緩沖液重復上述操作2次，取沉淀。

方法C(PBS):離心管加入3 mL PBS緩沖液和0.3 g玻璃珠，漩渦震蕩5min，200×g離心5 min，吸取上清液。在沉淀中加入3 mL PBS緩沖液重復洗滌兩次，合并三次上清液，12 000 rpm離心5 min，取沉淀。

1.4 DNA的提取和純化［2］

預處理后的沉淀中加入1 mL DNA抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L EDTA，100 mmol/LNa3PO4，1.5 mol/L NaCl)和5μ蛋白酶k(20 mg/mL)，200 r/min搖床37℃下30 min，在加入500μL 10%SDS 65℃水浴1 h。水浴后的樣品4℃下6000×g離心10 min，小心吸取上清于2 mL離心管，加入等體積酚氯仿異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，12 000 rpm離心10 min，取上清加入等體積氯仿異戊醇(24∶1)12 000 rpm離心10 min，取上清，重復兩次。上清液加入0.6體積預冷的異丙醇-20℃沉淀1 h，12 000 rpm離心10 min，小心倒掉液體。沉淀用70%乙醇洗滌數次。洗滌后的DNA用吹風吹干后TE溶解，-20℃保存。

1.5 DNA核酸蛋白儀檢測

提取的DNA樣品在核酸蛋白儀中測其OD230、260、280、340及OD260/280、OD260/230。

1.6 細菌v3區PCR

(1)引物:16S rDNA V3區PCR擴增所用的引物采用Muzyer等人所用的引物，可以擴增16S rDNA V3區約196bp的片段，對應E.coli16S rDNA 341到534的位點。在片段的一端加了富含GC的片段(GC clamp)，序列如下:

(2)PCR反應體系及程序:PCR反應需進行兩輪，第一輪反應體系為25μL:0.2μL Taq酶(5 u/μL)，2 μL dNTPs(2.5 mM)，2.5μL10×buffer，引物(10 pM)各1μl，模板DNA(10 ng)，18.3μL滅菌雙蒸水。程序:94℃預變性4 min;94℃變性1 min，應用降落PCR，65℃開始退火，每兩輪降低1℃，最終降至56℃，退火1min，72℃延伸1 min;再94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10個循環，72℃終延伸6 min。第二輪PCR反應(50μL):0.5μl Taq酶(5 u/μL)，4μL dNTPs(2.5 mM)，5μL10×buffer，引物(10 pM)各1μl，第一輪PCR產物模板DNA(5μL)，33.5μL滅菌雙蒸水，94℃預變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10個循環，終延伸72℃10 min。兩輪PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢驗，電壓約11 V/cm，電泳時間20 min，凝膠成像系統照相。

1.7 DGGE電泳

DGGE電泳條件:8%聚丙烯酰胺凝膠，DGGE采用30%～50%變性梯度(100%變性劑濃度為7 M尿素，40%甲酰胺)，上樣量為80 uL的PCR產物。電泳緩沖液為1×TAE，60℃，200 V電壓電泳3.5 h，SYBR GreenⅠ染色45 min，凝膠成像系統拍照。

2 結果與分析

2.1 核酸蛋白儀檢測結果分析

蛋白核酸定量檢測儀測定三種方法所提總DNA在280 nm、260 nm與230 nm下光吸收值，并以A260/A280與A260/A230分析DNA純度，根據DNA濃度換算出每克酒醅樣品中DNA含量。每種方法重復4次獨立實驗(n=4)，DNA濃度與DNA提取量以4次重復試驗的表示。P≤0.01表示具有顯著差異。實驗數據用STATA統計軟件分析完成。結果見表1。

表1 不同預處理方法提取DNA比較

從表1結果可以看出三種預處理方法均得到較高濃度的DNA，其中無菌水處理的樣品平均值達到95.725±2.804μg/mL，其次是PBS處理樣品平均值為66.375±4.224μg/mL，濃度最低為TENP處理樣，其平均值為56.475±9.601μg/mL。從獲得DNA濃度分析，無菌水處理樣品明顯高于其余兩種方法，而PBS緩沖液和TENP緩沖液處理樣DNA濃度差別不大。其原因可能由于TENP中的PVP與酒醅中的腐殖酸、酚類物質結合的時候，少量DNA分子也結合在一起，留在上清液中，造成DNA的損失。PBS處理是通過多次懸浮細胞來獲得菌體，由于少量細菌與酒醅結合在一起，振蕩后少量菌體仍留在酒醅中而損失。

DNA的純度可通過A260/A280比值表示，比值在1.8～2.0說明DNA純度較好，比值低于1.8說明樣品DNA存在蛋白質污染，比值高于2.0說明樣品存在RNA污染。樣品雜質的含量可以通過A260/A230比值來確定，即比值越高，雜質含量越低。無菌水、TENP、PBS三種預處理方法獲得的DNA樣品A260/A280平均值分別為1.645±0.045、1.535±0.047和1.855±0.024。其中無菌水和TENP處理樣低于1.8，說明樣品中存在蛋白質污染。無菌水處理樣品雖然DNA濃度較高，但各種雜質含量也是最高的，反映出DNA濃度越高其雜質含量也就越多，原因可能是雜質與DNA分子之間存在相互結合，其機理還未見相關報道，有待進一步研究。TENP緩沖液中的PVP可以和苯酚基化合物形成氫鍵，國內外大部分方法也應用PVP或是不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮去除腐殖酸［3-4］。從數據中可以看出用TENP處理樣品OD A340較低，說明TENP對去除樣品中的酚、腐殖酸有一定的效果。經過PBS處理的樣品，經過高速離心后，大量雜質都沉淀下來，從而獲得較純凈的菌液懸浮。

2.2 PCR擴增分析

圖1為第一輪PCR產物電泳圖，圖2為以第一輪PCR擴增產物為模板電泳圖，三種預處理方法均在預測大小片段200 bp處有目的條帶，擴增片段越清晰，條帶越明亮，擴增出目的DNA濃度越高。無菌水與TENP處理的樣品條帶較暗，PBS處理后的樣品，均有較亮條帶，說明PBS方法能較好的擴增出目的基因。

DNA模板中腐殖酸的存在，可以螯合Mg2+也可與DNA、蛋白質發生共價結合，從而抑制Taq酶的活性［5］。模板中蛋白質存在會阻礙引物與模板的結合，影響PCR擴增。無菌水樣品雖然DNA濃度較高，但雜質含量也高，從圖1、圖2看出，雜質較高的無菌水和TENP處理的樣品，其擴增目的DNA條帶較暗，證明了DNA模板中雜質會影響PCR擴增。PBS處理樣品中DNA濃度不高，但雜質含量較低，其擴增條帶明亮，能很好的擴增目的基因片段，說明經過該方法處理后獲得的酒醅微生物DNA，適合進行后續的操作。

2.3 V3區擴增片段DGGE分析

PCR-DGGE用于微生物群落結構的分析，一般要求目的片段在500 bp以下，對細菌群落的分析通常采用16S rRNA V3區片段［6-7］。根據DGGE能分離長度相同而序列不同DNA的原理，圖譜中不同條帶代表不同的細菌，電泳條帶越多表明分離的細菌種屬越多，條帶亮度越強表示該條帶代表的相應細菌數量越多［8-9］。三種預處理方法獲得的DGGE圖譜(圖3)中條帶的位置和數目均有差異，有的條帶位置相同但亮度(粗細)不同，對應其在DGGE梯度膠上的密度大小不同，有的條帶在DGGE梯度膠上出現的位置不一樣，有的則顯示空缺。無菌水處理的樣品有五條明顯條帶且條帶亮度較暗，TENP和PBS處理樣品獲得的DGGE圖譜具有相近的條帶數、條帶位置及相對豐度，表明兩種方法獲得的基因組DNA中菌群結構相似性較高。圖像圖譜分析表明PBS處理方法偵測條帶最高(Int值最高)，TENP處理方法次之，無菌水處理方法條帶最少。將三種方法處理的樣品獲得的相同優勢條帶進行峰面積積分(表2)。其中PBS處理方法獲得的各條帶清晰度最高。

圖3 細菌16SrDNA V3區擴增片段DGGE圖譜

表2 細菌16SrDNA V3區擴增片段DGGE指紋圖譜峰面積積分

3 討論

本實驗在三種預處理方法基礎上，采用SDS高鹽+蛋白酶K的方法提取得到酒醅中的微生物總DNA。實驗分析發現，DNA樣品中的雜質會嚴重影響PCR擴增，且DNA中雜質含量與DNA濃度成正相關，DNA濃度越高其雜質含量也高。無菌水和TENP處理的樣品在PCR第一輪和第二輪中擴增出條帶較暗，最終DGGE圖譜條帶數目與亮度也較差。PBS處理的樣品能很好的擴增出目的基因，DGGE圖譜分析及相似性分析均表明PBS處理方法較佳，通過PBS處理方法獲得的基因組DNA其DGGE圖譜中條帶明亮、豐度高，能很好反映樣品細菌的多樣性，有利于相關分子生物學分析。

分子生物學廣泛應用于酒醅微生物生態學研究中［10］，如用于構建環境微生物基因庫，用于動態分析群落變化規律以及微生物釀酒環境關系研究等。如何快速高效提取適于進一步分子生物學操作的微生物總DNA的方法成為關鍵技術。對酒醅樣品進行預先處理，是一種簡單有效的方法，能有效地去除大量雜質，保證后續分子生物學實驗的順利進行。本文比較了三種不同預處理方法，最終確定了PBS處理法為酒糟最佳預處理方法，可用于酒醅環境中細菌基因組DNA的提取。

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