伊布利特對(duì)兔左心室中層細(xì)胞瞬間外向鉀電流活性的影響

宋春麗 董巍 趙剛 劉紅彬 王麗婭 吉麗

伊布利特是一種新型的Ⅲ類抗心律藥物，其對(duì)房顫、房撲的轉(zhuǎn)復(fù)治療有明顯效果，但對(duì)室性心律失常的研究筆者所見報(bào)道不多。本文采取酶解法分離兔單個(gè)M細(xì)胞，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，通過離子通道角度觀察不同濃度的伊布利特對(duì)M細(xì)胞瞬間外向鉀電流(transient outside potassium current，Ito)活性的影響，為伊布利特用于臨床室性心律失常治療提供一定的基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭純種白兔60只，雌雄兼用，重量2．3～2．5 kg。由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)溫度18～29℃，相對(duì)濕度40% ～70%，顆粒飼料喂養(yǎng)。

1．2 液體配制 (1)Tyrode液、酶液、細(xì)胞保存液、Ito電極內(nèi)液、Ito細(xì)胞外液的配置參照文獻(xiàn)［1］;(2)伊布利特液:伊布利特10 mg，三水醋酸鈉18．9 mg，氯化鈉890 mg，用鹽酸調(diào)整pH值約4．6和注射用水適量加至100 ml，溶液配制完畢后充以100%的氧氣5 min以上;(3)富馬酸伊布利特由石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)在含有Ito的灌流液中加入伊布利特，使其最終的濃度達(dá)10－5mol/L、10－6mol/L。

1．3 單細(xì)胞分離［2］報(bào)道的方法分離出單個(gè)的心室肌細(xì)胞。整個(gè)過程保持恒溫36℃同時(shí)充入氧氣。

1．4 膜片鉗全細(xì)胞記錄［2］選擇條理清晰、表面光滑的單個(gè)心室肌細(xì)胞在25℃室溫下分別用正常的Ito外液和加入伊布利特 10－5mol/L、10－6mol/L 的 Ito 外 液 灌 流，灌 流 時(shí) 間5～10 min，速度為2 ml/min，使之達(dá)到規(guī)定的濃度，細(xì)胞破膜后穩(wěn)定5 min后分別記錄3組細(xì)胞液灌流后電流。

1．5 Ito記錄方法 先將細(xì)胞鉗制在－40 mV，50 ms后依次階躍10 mV去極化至 +110 mV，時(shí)程250 ms，刺激頻率0．5 Hz。以電壓為橫坐標(biāo)，電流密度為縱坐標(biāo)得到電流-電壓曲線(I-V曲線)，比較3組I-V曲線及+60 mV的Ito峰值電流密度變化。采用雙脈沖刺激法，先將細(xì)胞鉗制在 －50 mV，超極化至－160 mV，持續(xù)250 ms，階躍10 mV，去極化至 +70 mV，以電壓值為橫坐標(biāo)，以Ito電流濃度為縱坐標(biāo)，得到Ito的失活曲線。觀察3組的Ito電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活曲線及V0．5(半數(shù)失活電壓)的變化。當(dāng)HP=－40 mV，去極化到+60 mV，測(cè)試脈沖與條件脈沖的間隔開始為30 ms，增量為15 ms逐級(jí)遞增至165 ms。以測(cè)試脈沖與條件脈沖的Ito之比為橫坐標(biāo)，與恢復(fù)時(shí)間間隔為橫坐標(biāo)作圖，得失活后再恢復(fù)曲線。觀察3組的Ito失活后再恢復(fù)過程的變化。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 伊布利特對(duì)I-V曲線的影響 3組呈電壓及濃度依賴性線形激活過程，10－5mol/L組，10-6 mol/L組I-V曲線均下移，對(duì)照組細(xì)胞在 －30 mV激活，伊布利特10-6 mol/L組在+10 mV激活，伊布利特10－5mol/L組在+20 mV激活。測(cè)試電壓+60 mV時(shí)電流密度顯示:對(duì)照組(n=14 cells)為(17．4±5．2)pA/pF，10－6mol/L 組(n=14 cells)為(6．0 ±1．2)pA/pF，與對(duì)照組相比下降明顯(P ＜0．01)。10－5mol/L組(n=14 cells)為(4．5±1．1)pA/pF，與對(duì)照組比較有明顯下降(P ＜0．01)。10－5mol/L組與10－6mol/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。用藥前及低、高劑量伊布利特灌流后Ito形態(tài)曲線見圖1。3種狀態(tài)下Ito的I-V曲線見圖2。

2．2 伊布利特對(duì)穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 10－5mol/L組、10－6mol/L組失活曲線顯著左移，以10－5mol/L組明顯。3組的半數(shù)最大失活電壓，對(duì)照組(n=12 cells)為－(72．0±3．4)mV，10－6mol/L組(n=14 cells)為 － (109．4 ±4．6)mV，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)，10－5mol/L組(n=14 cells)為 －(127．1 ±2．8)mV，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)，10－5mol/L 組和 10－6mol/L 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)。見圖3。

圖1 3組細(xì)胞的鉀電流原始圖

圖2 3組細(xì)胞的鉀電流I-V曲線圖

圖3 3組細(xì)胞的鉀電流穩(wěn)態(tài)失活曲線圖

2．3 伊布利特對(duì)失活后再恢復(fù)曲線的影響 當(dāng)2個(gè)脈沖間隔時(shí)間為45 ms時(shí)，對(duì)照組(n=12 cells)恢復(fù)42%，10－6mol/L組(n=15 cells)恢復(fù)31%，10－5mol/L組(n=15 cells)恢復(fù)25%，10－6mol/L，10－5mol/L組失活后再恢復(fù)與對(duì)照組相比，明顯減慢(P＜0．01)。當(dāng)2個(gè)脈沖間隔時(shí)間為90 ms時(shí)，對(duì)照組(n=12 cells)恢復(fù)82%，10－6mol/L組(n=15 cells)恢復(fù)66%，10－5mol/L 組(n=15 cells)恢復(fù) 55%，10－6mol/L 和10－5mol/L組失活后再恢復(fù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)。見圖 4。比較 3 組細(xì)胞在 45、90、120、165 ms失活后再恢復(fù)的程度，說明再恢復(fù)減慢。見圖5。3組Ito失活后再恢復(fù)的原始電流圖，顯示伊布利特10－5mol/L和10－6mol/L組使Ito電流減小，再恢復(fù)減慢，其中10－5mol/L減慢最為明顯。見圖6。

圖4 3組細(xì)胞的鉀電流失活后再恢復(fù)曲線圖

圖5 3組細(xì)胞的失活后再恢復(fù)的程度比較

圖6 3組細(xì)胞的鉀電流失活后再恢復(fù)原始記錄圖

3 討論

伊布利特應(yīng)用于臨床房顫、房撲的藥物轉(zhuǎn)復(fù)已作為Ⅰ類A級(jí)適應(yīng)證寫入2006年ACC/AHA/ESC心房顫動(dòng)治療指南。伊布利特對(duì)房性心律失常的治療有較好的療效。該藥對(duì)室性心律失常也有抑制作用。伊布利特延長(zhǎng)心室肌的有效不應(yīng)期和QT間期，其增加心室跨壁復(fù)極離散度的作用呈劑量依賴性。伊布利特減慢心室率，有抑制室速、室顫的作用，并能降低室顫除顫的閾值［3］。但其抗室性心律失常的確切電生理機(jī)制尚不清楚。

有研究認(rèn)為，國產(chǎn)伊布利特的臨床應(yīng)用將能影響我國心律失常藥物治療的現(xiàn)狀［4］。其主要電生理機(jī)制為抑制復(fù)極時(shí)K+外向電流(Ikr)，促進(jìn)平臺(tái)期緩慢內(nèi)向Na+電流，抑制0相快鈉內(nèi)流，促進(jìn)平臺(tái)期內(nèi)向Ca2+內(nèi)流，此電生理機(jī)制已得到專家共識(shí)［3］，但其對(duì)Ito的研究筆者尚未見相關(guān)報(bào)道。Ito電流在動(dòng)作電位的早期出現(xiàn)，與動(dòng)作電位的1相有關(guān)，并參與動(dòng)作電位的2相平臺(tái)期早期，它的改變可對(duì)動(dòng)作電位時(shí)限產(chǎn)生較大影響。Ito分2型:Ito1和Ito2，Ito1對(duì)4-氨基吡啶(4-aminopyridine)敏感，又稱4-aminopyridine敏感型的瞬時(shí)外向鉀電流;實(shí)驗(yàn)細(xì)胞外液中加入CdCl2以阻斷細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和電極內(nèi)液中含EGTA螯合細(xì)胞內(nèi)鈣離子，從而達(dá)到阻斷Ito2而記錄Ito1。通常所指的Ito為Ito1，與心律失常的產(chǎn)生關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn):伊布利特用藥組Ito電流峰值不同程度的下降，激活電壓及峰值右移，I-V曲線均下移，失活曲線、半數(shù)失活電壓明顯左移，失活后再恢復(fù)減慢，這些變化引起心肌細(xì)胞1相復(fù)極延遲，并導(dǎo)致動(dòng)作電位2相平臺(tái)期相對(duì)延長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)心室肌有效不應(yīng)期、動(dòng)作電位時(shí)程和QT間期，使傳導(dǎo)減慢，故對(duì)室性心律失常起抑制作用。伊布利特引起心肌細(xì)胞Ito的抑制呈濃度依賴性，高濃度組的伊布利特對(duì)Ito抑制作用明顯強(qiáng)于低濃度組。

Ito在左心室游離壁的分布呈現(xiàn)出跨壁梯度，從心內(nèi)膜到心外膜Ito密度逐漸增加，這被認(rèn)為是心室壁心肌細(xì)胞電生理性質(zhì)空間變異性產(chǎn)生的重要原因。有學(xué)者認(rèn)為Ito的這種分布梯度也可能是決定整個(gè)心臟復(fù)極和除極順序的電學(xué)基礎(chǔ)，是導(dǎo)致2相全或無復(fù)極、動(dòng)作電位平臺(tái)期不一致改變和2相折返的最重要的離子流之一，2相折返的機(jī)制與Ito跨心肌壁復(fù)極不均一性有關(guān)，促進(jìn)室速或室顫的發(fā)生［5］。伊布利特作用心室肌M細(xì)胞后顯示:伊布利特抑制Ito，從而使1相復(fù)極延遲，并導(dǎo)致動(dòng)作電位2相平臺(tái)期相對(duì)延長(zhǎng)。使復(fù)極趨向一致，消除心室復(fù)極離散度，有利于消除折返，抑制室性快速心律失常的發(fā)生。

M細(xì)胞最顯著的特征是其具有比心內(nèi)、外膜層肌細(xì)胞明顯長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程(APD)，具有明顯的慢頻率依賴性和較優(yōu)勢(shì)的Ito［6］。是否延長(zhǎng)QT間期是III類抗心律失常藥物發(fā)揮作用的表現(xiàn)。在緩慢心率或刺激條件下，伊布利特對(duì)M細(xì)胞Ito的抑制作用，使其QT間期過度延長(zhǎng)并在此基礎(chǔ)上易產(chǎn)生后除極(EAD)，局部EAD引起觸發(fā)活動(dòng)，易導(dǎo)致尖端扭轉(zhuǎn)性室速。尤其見于女性、高齡、低鉀血癥、低鎂血癥、心力衰竭與心肌肥厚患者［7－9］。發(fā)生尖端扭轉(zhuǎn)室速時(shí)應(yīng)立即行直流電復(fù)律。

綜上所述，伊布利特對(duì)心室肌細(xì)胞Ito的抑制作用可部分解釋其抗室性心律失常的離子機(jī)制。由于本研究樣本數(shù)較少，存在一定的局限性，有待進(jìn)一步增加樣本例數(shù)深入研究。且僅對(duì)動(dòng)物正常的心室肌細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室觀察，對(duì)臨床應(yīng)用是否抑制室性心律失常的發(fā)生或轉(zhuǎn)復(fù)須進(jìn)一步觀察。

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