葛根素對腦缺血大鼠腦組織MMP-9表達和腦水腫的影響

封 菲 洪鳴鳴 高 越 杭州市第一人民醫院老年科 杭州310003

基質金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9，MMP-9）屬于基質金屬蛋白酶家族，能夠降解和重塑細胞外基質。已有研究［1］，證實腦缺血再灌注后MMP-9 表達增多，并通過降解基底膜和連接蛋白而破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），導致血管源性腦水腫。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，有研究［2］證實，葛根素具有擴張腦血管，改善微循環，抗血小板聚集，從而降低血液黏滯度以及抗氧自由基等多重途徑起到腦保護的作用。本研究擬通過觀察葛根素對大鼠腦缺血再灌注后是否能抑制MMP-9的表達，減輕血腦屏障的破壞和腦水腫，探討葛根素腦保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備及處理 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只，體質量250～300g，清潔度Ⅱ級，由浙江省醫學科學院動物中心提供，隨機分為假手術組、對照組和藥物組，每組18只，各組再平均分為三個亞組，分別用于血腦屏障通透性測定、腦含水量測定及免疫組化。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，按照Bederson 等［3］的方法制作大鼠腦缺血再灌注模型，手術前后大鼠肛溫維持在（37±0.5）℃。缺血90min 后抽提栓線至頸外動脈殘端內進行再灌注。藥物組于缺血前1h 給予葛根素注射液（劑量70mg/kg）腹腔內注射，隨后每間隔8h 再次注射，對照組及假手術組給予等量生理鹽水。

1.2 試劑和儀器 葛根素注射液（浙江康恩貝制藥公司）、伊文思藍（Evan's blue，EB）溶液（sigma 公司）、兔抗大鼠MMP-9 多克隆抗體、SABC 試劑盒及DAB 顯色劑（武漢博士德生物公司）、Olympus-CH2顯微鏡（日本歐林巴斯光學工業株式會社）

1.3 BBB 通透性測定 大鼠處死前2h，尾靜脈注入2%EB 2mL/kg。再灌注48h時，用1%肝素生理鹽水經心室灌流，然后迅速取損傷側腦組織，稱取濕重后置入加有5mL 甲酰胺的試管中，54℃恒溫培養箱孵育24h，讓組織中的EB 充分溶解在甲酰胺溶液中。將溶有EB的甲酰胺溶液過濾，用分光光度計（波長632nm）測各管吸光度（A）值，并制作EB標準曲線得出線性回歸方程，根據此線性回歸方程計算溶液中EB濃度，以每克腦組織濕重所含EB的微克數（μg/g）表示BBB通透性。

1.4 腦組織含水率測定 采用干濕稱重法。大鼠快速斷頭取腦，取右側大腦半球用電子天平獲取濕重，置入100攝氏度恒溫干燥箱內48h再獲取干重，腦組織含水率計算公式：（濕重-干重）/濕重×100%

1.5 腦組織MMP-9 表達 采用免疫組織化學技術檢測。大鼠腦缺血再灌注48h時以4%多聚甲醛液約200mL經心臟灌注固定，快速斷頭冰盤上取腦，視交叉和其后4mm 處兩點冠狀切片，片厚4mm，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、用切片機連續5mm 厚冠狀切片。石蠟切片經常規脫蠟、水化、煮沸法修復，過氧化氫阻斷，滴加兔抗大鼠MMP-9 多克隆抗體（工作濃度1：100），根據SABC試劑盒說明書對切片標本進行操作，予DAB 顯色，自來水沖洗后蘇木素復染，脫水、封片，表達MMP-9 處在光鏡下為棕黃色物質。每張切片先在低倍鏡下觀察，在腦梗死皮質缺血區的位置隨機采集5個不重疊的高倍視野（×400），計數每張切片的總陽性細胞數。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織EB 含量和含水率比較 對照組及藥物組大鼠腦組織EB 含量及含水率較假手術組顯著增加（P＜0.05）；與對照組比較，藥物組腦組織EB含量及含水率明顯減少（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠腦組織EB含量及腦組織含水率比較（）

表1 各組大鼠腦組織EB含量及腦組織含水率比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與假手術組比較，△P＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織MMP-9 表達 三組大鼠的左側（未缺血側）大腦半球基本未見陽性細胞（每張切片的5個高部視野下MMP-9 總陽性細胞數為1.33±1.20），而對照組和藥物組大鼠的右側大腦半球皮質缺血區均可見胞漿呈棕黃色的MMP-9 陽性細胞表達。藥物組MMP-9 陽性細胞數（33.50±2.17），較對照組（38.17±3.13）明顯減少（P＜0.05）。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是臨床上腦外傷、腦腫瘤、腦血管病等許多疾病伴發的常見病理損害過程，腦缺血再灌注損傷后的直接結果是形成腦水腫，而血管源性水腫是腦水腫的始動因素，在腦組織含水量和顱內壓變化中起著關鍵作用，也是針對腦水腫采取干預措施的主要對象。

MMPs是參與組織重塑的鋅依賴的內肽酶，正常時以酶原形式存在，在細胞外激活，MMPs 可降解多種細胞外基質蛋白包括血腦屏障的神經血管基底膜和緊密連接蛋白因而成為研究熱點［4］。它的調節是復雜和嚴格的過程，其調節失控與創傷性腦損傷、腦卒中及神經變性時血腦屏障破壞和突觸丟失相關［5-8］。MMP-9 基因缺失小鼠在腦外傷及卒中［9-10］的對照試驗中均出現水腫和炎癥反應的減輕及腦白質完整性和神經功能的改善。一系列應用MMP 抑制劑的實驗也證實可減輕腦水腫和腦梗死。但也有研究證實MMP具有雙相作用［11］。它在腦外傷和卒中后康復階段的神經再生、神經血管重塑中起重要作用［11-12］。

Rosenberg 等［13］發現在腦缺血再灌注損傷后24h MMP-9開始有表達，48h后可在血管內皮細胞、中性粒細胞、神經元中觀察到MMP-9陽性細胞表達。多項研究發現腦缺血再灌注后MMP-9 表達高峰和BBB破壞及腦水腫高峰均在腦缺血再灌注后48h。

本實驗選取腦缺血再灌注后48h為時間點，發現缺血再灌注后大鼠缺血區周邊皮質內皮細胞、神經細胞中MMP-9表達顯著增多，血腦屏障通透性和腦組織含水率也顯著增加，表明MMP-9參與了腦缺血再灌注損傷；本實驗中藥物組大鼠缺血側腦組織內的EB 含量和腦組織含水率也較對照組下降（P＜0.05），提示葛根素干預后腦缺血再灌注大鼠BBB破壞程度和腦水腫得到減輕；研究還發現葛根素干預可減少大鼠腦缺血再灌注48h 后MMP-9的表達，我們推測葛根素可能通過下調MMP-9表達，減輕BBB的破壞和腦水腫，從而在腦缺血再灌注損傷中發揮其保護作用。

葛根素在臨床上廣泛地應用于缺血性腦血管病的治療。葛根素具有擴張腦血管，改善微循環，降低血漿內皮素，抗血小板聚集，抗氧自由基，緩解腦血管痙攣，阻斷局部缺血缺氧及細胞內鈣超載的惡性連鎖反應，抑制誘生型NO 合酶系統的激活，干預細胞凋亡等作用［2］。本研究表明，葛根素可能通過抑制MMP-9的活化和減輕血腦屏障通透性起到腦缺血再灌注損傷的腦保護作用。

［1］Rosenberg GA，Yang Y.Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia［J］.Neurosurg Focus，2007，22（5）：E4.

［2］潘洪平，楊嘉珍，莫祥蘭，等.葛根素注射液對急性腦缺血模型大鼠腦細胞損傷的保護作用［J］.中國中藥雜志，2005，30（6）：457-459.

［3］Berderson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）：472-476.

［4］Grossetete M，Phelps J，Arko L，et al.Elevation of matrix metalloproteinases 3 and 9 in cerebrospinal fluid and blood in patients with severe traumatic brain injury［J］.Neurosurg，2009，65（4）：702-708.

［5］Candelario-Jalil E，Yang Y，Rosenberg GA.Diverse roles of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in neuroinflammation and cerebral ischemia［J］.Neuroscience，2009，158（3）：983-994.

［6］Ding JY，Kreipke CW，Schafer P，et al.Synapse loss regulated by matrix metalloproteinases in traumatic brain injury is associated with hypoxia inducible factor-1alpha expression［J］.Brain Res，2009，1268（5）：125-134.

［7］Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and their multiple roles in neurodegenerative diseases［J］.Lancet Neurol，2009，8（2）：205-216.

［8］Rosenberg GA，Yang Y.Vasogenic edema due to tight junction disruption by matrix metalloproteinases in cerebral ischemia［J］.Neurosurg Focus，2007，22（2）：E4.

［9］Asahi M，Wang X，Mori T，et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of bloodbrain barrier and white matter components after cerebral ischemia［J］.J Neurosci，2001，21（19）：7724-7732.

［10］Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al.Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289（2）：H558-H568.

［11］Zhao B-Q，Wang S，Kim H-Y，et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke［J］.Nat Med，2006，12（4）：441-445.

［12］Falo MC，Fillmore HL，Reeves TM，et al.Matrix metalloproteinase-3 expression profile differentiates adaptive and maladaptive synaptic plasticity induced by traumatic brain injury［J］.J Neurosci Res，2006，84（4）：768-781.

［13］Rosenberg GA，Cunningham LA，Wallace J，et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain activation of MMP-9 llinked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures［J］.Brain Res，2001，893（1～2）：104-112.