魷魚(yú)肌肉組織細(xì)菌基因組DNA 提取方法的優(yōu)化

王建玲，趙鵬程，鄧弘毅，金 楊

(1.臺(tái)州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 臺(tái)州 318000;2.浙江師范大學(xué)，浙江 金華 321004)

魷魚(yú)，也稱(chēng)柔魚(yú)、槍烏賊，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，是廣受歡迎的水產(chǎn)品之一。近20年來(lái)，隨著遠(yuǎn)洋漁業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)魷魚(yú)產(chǎn)業(yè)也出現(xiàn)了跨越式發(fā)展。目前，全國(guó)魷魚(yú)產(chǎn)業(yè)企業(yè)已達(dá)到40 多家，魷釣生產(chǎn)作業(yè)漁船達(dá)到480 多艘，魷魚(yú)捕獲量達(dá)到42.8 萬(wàn)t，占全國(guó)海洋漁業(yè)產(chǎn)量的37.2%，占世界魷魚(yú)產(chǎn)量的50%。但由于冰鮮魷魚(yú)水分含量高，蛋白質(zhì)豐富，且冰鮮魷魚(yú)在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、貯藏等過(guò)程中往往會(huì)受到微生物的污染，導(dǎo)致冰鮮魷魚(yú)的貨架期很短，進(jìn)而引發(fā)一系列食品安全問(wèn)題。

目前，我國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中菌群多樣性的研究大多仍用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，但由于自然界中有85%～99%的微生物至今還不可培養(yǎng)，因此傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法具有一定的局限性［1］。隨著現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法如變性梯度凝膠電泳 (DGGE)等的日趨成熟，研究者可以有效地避開(kāi)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，直接在分子水平上對(duì)水產(chǎn)品中菌群多樣性進(jìn)行研究。但利用分子生物學(xué)方法對(duì)菌群多樣性進(jìn)行研究時(shí)，首要解決的問(wèn)題是菌群基因組DNA 的提取。常見(jiàn)的細(xì)菌基因組DNA 提取方法有十二烷基苯磺酸鈉 (SDS)法、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、溶菌酶法、超聲波法或幾種方法的組合。作者以SDS 法、CTAB 法和溶菌酶法為基礎(chǔ)，采用兩兩結(jié)合的方法對(duì)魷魚(yú)組織中的細(xì)菌基因組DNA 進(jìn)行提取，并比較了3種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮魷魚(yú)為購(gòu)自金華市果蔬水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)的冰鮮魷魚(yú)，無(wú)菌水洗滌，室溫放置至出現(xiàn)輕度腐敗味時(shí)進(jìn)行取樣分析。

1.2 魷魚(yú)肌肉組織中細(xì)菌總DNA 的提取

1.2.1 前處理

在無(wú)菌操作下將魷魚(yú)肌肉組織剪碎，稱(chēng)取3 份10 g 樣品，置于無(wú)菌錐形瓶中，加入10 g 無(wú)菌玻璃珠和90 mL 無(wú)菌TE 緩沖液，200 r·min-1、4℃振蕩處理30 min，靜置5 min，取上清液50 mL，10 000 r·min-1離心10 min，用于細(xì)菌總DNA 的提取。

1.2.2 SDS 法結(jié)合CTAB 法

所得沉淀用10 mL TE 懸浮，加入0.5 mL 10%SDS，50 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K，混勻，37℃孵育1 h。加入1.5 mL 5 mol·L-1NaCl，1.5 mL CTAB/NaCl 溶液，混勻，65℃孵育20 min。用等體積酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1)抽提，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，重復(fù)上述操作直至兩相交界面無(wú)白色物質(zhì)出現(xiàn)為止。取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇 (24 ∶1)，10 000 r·min-1離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，10 000 r·min-1離心15 min 得到DNA 沉淀。加入700 μL 75% 乙醇，70 μL 3 mol·L-1NaAc 漂洗DNA 沉淀后，溶解于1 mL TE，-20℃保存。

1.2.3 SDS 法結(jié)合溶菌酶法

所得沉淀用10 mL TE 懸浮，加入溶菌酶至終濃度10 mg·mL-1，加入0.5 mL 10% SDS，50 μL 20 mg·mL-1蛋白酶K，混勻，37℃孵育1 h。加入1.5 mL 5 mol-1NaCl，混勻，65℃孵育20 min。用等體積酚∶氯仿∶異戊醇 (25 ∶24 ∶1)抽提，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，重復(fù)上述操作直至兩相交界面無(wú)白色物質(zhì)出現(xiàn)為止。取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇 (24∶1)，10 000 r·min-1離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，10 000 r·min-1離心15 min 得到DNA 沉淀。加入700 μL 75%乙醇，70 μL 3 M NaAc漂洗DNA 沉淀后，溶解于1 mL TE，-20℃保存。

1.2.4 CTAB 法結(jié)合溶菌酶法

所得沉淀用10 mL TE 懸浮，加入溶菌酶至終濃度10 mg·mL-1，混勻，37℃孵育1 h。加入1.5 mL 5 mol·L-1NaCl，1.5 mL CTAB/NaCl 溶液，混勻，65℃孵育20 min。用等體積酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1)抽提，10 000 r·min-1離心10 min，取上清，重復(fù)上述操作直至兩相交界面無(wú)白色物質(zhì)出現(xiàn)為止。取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，10 000 r·min-1離心10 min。取上清，加入等體積異丙醇，混勻，-20℃靜置1 h，10 000 r·min-1離心15 min 得到DNA 沉淀。加入700 μL 75%乙醇，70 μL 3 mol·L-1NaAc 漂洗DNA 沉淀后，溶解于1 mL TE，-20℃保存。

1.3 DNA 樣品純度和濃度的檢測(cè)

用Thermo Scientific NanoDrop ND-1000 微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的純度和濃度。

1.4 1 500 bp16S rDNA 片段的PCR 擴(kuò)增

PCR 引 物:8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3’)和1510R (5’-GGCTACCTTGTTAC GA-3’)。

PCR 反應(yīng)體系:Primer 1 μL，10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 5.0 μL，DNA 1.0 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL 和ddH2O 37.7 μL。

PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸2 min。

1.5 16S rDNA V3 區(qū)片段的PCR 擴(kuò)增

PCR 引物:GC357F (5’-CGCCCGCCGCGCGC GGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGCCACCTACGGGAG GCAGCAG-3’)和517R (5’-ATTACCGCGGCTGC TGG-3’)。

PCR 反應(yīng)體系:Primer 1 μL，2× GC Buffer II 25.0 μL，dNTP Mixture 8.0 μL，DNA 1.0 μL，TaKaRa La Taq 0.5 μL 和ddH2O 14.5 μL。

PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，305個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。

1.6 DGGE 圖譜的建立與分析

DGGE 電泳采用Muyzer 等［2］的方法，電泳條件為恒溫60℃，電壓85 V，聚丙烯酰胺凝膠的濃度8%，電泳時(shí)間14 h。電泳結(jié)束后，EB 染液浸染15 min，再用ddH2O 漂洗5 min，UVP 凝膠成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總DNA 的提取

圖1 表明，3種方法均能成功提取魷魚(yú)肌肉組織細(xì)菌的總DNA。其中，SDS 法結(jié)合CTAB 法和SDS 法結(jié)合溶菌酶法提取細(xì)菌總DNA 所得的DNA電泳條帶亮度相似，CTAB 法結(jié)合溶菌酶法提取的DNA 電泳條帶亮度最暗。

圖1 3種方法提取的魷魚(yú)肌肉組織中細(xì)菌總DNA 的電泳結(jié)果

2.2 DNA 的純度及濃度

純度檢測(cè)結(jié)果 (表1)表明，3種方法所提取的細(xì)菌基因組DNA 的D260/D280值1.81～1.91，D260/D230值2.28～2.37，說(shuō)明所提DNA 純度較高，可以直接用于進(jìn)一步的PCR 擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)。濃度檢測(cè)結(jié)果表明，SDS 法結(jié)合CTAB 法和SDS 法結(jié)合溶菌酶法提取細(xì)菌總DNA 的濃度較高，CTAB 法結(jié)合溶菌酶法的提取的濃度較低。

表1 3種方法提取的魷魚(yú)肌肉組織細(xì)菌總DNA 的純度及濃度

2.3 1 500 bp 16S rDNA 片段的PCR 擴(kuò)增

以提取的魷魚(yú)肌肉組織細(xì)菌總DNA 為模板，以8F 和1510R 為引物進(jìn)行第1 套PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖2 所示，所得產(chǎn)物是大小約1 500 bp 的16S rDNA 片段。

圖2 3種方法提取的魷魚(yú)肌肉組織中細(xì)菌總DNA 1 500 bp16S rDNA 片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 16S rDNA V3 區(qū)片段的PCR 擴(kuò)增

以第1 套PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以GC357F 和517R 為引物進(jìn)行第2 套PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖3 所示，所得產(chǎn)物是大小約160 bp 的片段。

圖3 3種方法提取的魷魚(yú)肌肉組織中細(xì)菌總DNA 16S rDNA V3 區(qū)片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.5 DGGE 圖譜的建立

用第2 輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在變性梯度30%～60%進(jìn)行DGGE 電泳，結(jié)果如圖4 所示。SDS 法結(jié)合CTAB 法所提取的細(xì)菌總DNA 的條帶最多，為7條，SDS 法結(jié)合溶菌酶法和CTAB 法結(jié)合溶菌酶法相似，為6 條，但是SDS 法結(jié)合溶菌酶法的條帶較CTAB 法結(jié)合溶菌酶法亮。

圖4 3種方法提取的魷魚(yú)肌肉組織中細(xì)菌總DNA 16S rDNA V3 區(qū)的DGGE 圖譜

3 小結(jié)與討論

基于PCR 技術(shù)的分子方法是調(diào)查環(huán)境樣品中微生物多樣性的有效方法［3］，其中從樣品中直接提取微生物總DNA 是分子生物學(xué)方法的關(guān)鍵步驟，常見(jiàn)的提取微生物總DNA 的方法有SDS 法、CTAB法、溶菌酶法等。SDS 是一種陰離子去垢劑，能裂解細(xì)胞，使核蛋白與核酸復(fù)合體分離，直接釋放出DNA［4］。CTAB 是一種陽(yáng)離子去污劑，能裂解細(xì)胞，并能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會(huì)因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA 和多糖分開(kāi)［5］。溶菌酶是一類(lèi)能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶，因此能達(dá)到裂解細(xì)胞的目的，該酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的裂解作用，對(duì)部分革蘭氏陰性菌，如埃希氏大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏菌等，也具有一定的作用［6］。

本研究以3種提取方法為基礎(chǔ)，采用兩兩結(jié)合的方法對(duì)魷魚(yú)組織中的細(xì)菌基因組DNA 的提取效果進(jìn)行了比較。瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法對(duì)所提DNA 濃度檢測(cè)結(jié)果表明SDS 法結(jié)合CTAB 法和SDS 法結(jié)合溶菌酶法所提取細(xì)菌總DNA 的量相近，均較CTAB 法結(jié)合溶菌酶法多，說(shuō)明SDS 法結(jié)合CTAB 法和SDS 法結(jié)合溶菌酶法提取細(xì)菌總DNA的效果相似，CTAB 法結(jié)合溶菌酶法提取細(xì)菌總DNA 的效果最差。分光光度法和PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)對(duì)所提DNA 純度檢測(cè)的結(jié)果表明，3種方法所提取的細(xì)菌總DNA 純度較高，無(wú)需純化即可進(jìn)行進(jìn)一步PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

雖然DNA 提取質(zhì)量的高低一般通過(guò)檢測(cè)DNA的濃度與純度來(lái)判斷，但由于細(xì)菌總DNA 提取方法的不同可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌裂解度的不同［7］，使得所釋放的DNA 量不同，或因提取液中抑制劑殘留水平不同，從而影響PCR 的特異性擴(kuò)增［8］，最終引起樣本中菌群多樣性的缺失。DGGE 是目前研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一［9］，是一種能真實(shí)揭示樣品中的微生物組成和動(dòng)態(tài)變化的方法。DGGE 電泳結(jié)果表明，SDS 法結(jié)合CTAB法所提細(xì)菌總DNA 的條帶最多，為7 條，SDS 法結(jié)合溶菌酶法和CTAB 法結(jié)合溶菌酶法相似，為6條，但是SDS 法結(jié)合溶菌酶法的條帶較CTAB 法結(jié)合溶菌酶亮，說(shuō)明SDS 法結(jié)合CTAB 法較另兩種方法能更為真實(shí)地揭示待測(cè)樣本中微生物的實(shí)際組成。

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