高效液相色譜測定不同采收期羅布麻中黃酮含量

石雪萍， 吳亮亮

（1.江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 工程技術(shù)學(xué)院/江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇 南京 210007；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042）

羅布麻 （Apocynum venetum）分為紅麻和白麻兩種，為夾竹桃科多年生直立半灌木草本植物，是一種具有多種經(jīng)濟用途和生態(tài)用途的資源植物。羅布麻具有耐鹽堿、耐嚴寒和酷暑的特性，廣泛生長在鹽堿、沙荒地帶，集中在新疆、內(nèi)蒙、甘肅、青海等省區(qū)，因最早發(fā)現(xiàn)于新疆羅布泊，故命名為羅布麻[1]。用羅布麻葉作飲茶及藥用有悠久的歷史，《中國藥植圖鑒》記載羅布麻：“嫩葉，蒸炒揉制后代茶，有清涼去火，防止頭暈和強心的功用。”《陜西中草藥》記載其具有“清涼瀉火，強心利尿，降血壓。治心臟病，高血壓，神經(jīng)衰弱，腎炎浮腫”的功效。現(xiàn)代研究表明，羅布麻中的有效成分主要有黃酮類、鞣質(zhì)類、有機酸類、醇類、氨基酸類等[2-3]，具有降壓、降脂、抗感冒、鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁等功效[4-10]。羅布麻最主要成分為黃酮類成分。近年來國內(nèi)外關(guān)于羅布麻中黃酮的研究甚多，主要有總黃酮的測定：范維剛等人研究了羅布麻葉中黃酮類化合物含量的測定[11]，劉東平研究了羅布麻黃酮測定方法[12]；黃酮的分離：耿巖玲等利用高速逆流色譜從羅布麻中分離得到了異槲皮素甙[13]；張云峰等人從羅布麻中分離得到了8種化合物，3種為黃酮類成分，其中有槲皮素和異槲皮素甙[14]。程秀麗將羅布麻的乙醇提取物經(jīng)聚酰胺柱、Sephadex LH-20，反復(fù)分離純化得到幾種黃酮類化合物三葉豆苷、金絲桃苷、槲皮素、乙酰異槲皮苷與異槲皮苷[15]。作者以新疆阿拉泰地區(qū)的羅布紅麻為原料，利用高效液相色譜法測定不同采收期羅布麻茶中的幾種黃酮含量，旨在尋找最佳的采收期，并可根據(jù)需要選擇不同的采收期，從而更加合理地利用這種戈壁珍品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻樣品采自新疆阿拉泰。按照采收期分別標記為 1#，6 月份采摘；2#，7 月份采收；3# 樣品，8月份采收；4#樣品，9月份采收；5#樣品，8月份采收熱水浸泡。

蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素甙、槲皮素對照品（純度≥98%），南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、磷酸為HPLC級，水為純凈水。其它試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器 （DAD）、安捷倫化學(xué)工作站、Zorbax保護住（H4033A）：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；JA3103N分析天平：上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；T6新世紀紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液制備 精密稱取4.8 mg異槲皮苷，5.5 mg金絲桃苷，5.4 mg蘆丁和5.8 mg槲皮素，甲醇定容至10 mL，樣品濃度分別為 0.48、0.55、0.54、0.58 mg/mL，并將母液稀釋成5個濃度梯度的對照品溶液，待進樣。

1.3.2 供試樣品溶液的制備 將不同時期采摘的羅布麻葉干燥，粉碎過40目篩。分別稱取1#、2#、3#、4#樣品2 g，加入體積分數(shù)60%乙醇溶液100 mL，超聲提取60 min，過濾取濾液；稱取5#樣品2 g，100 mL沸水泡制3次，合并，過濾取濾液。濾液上樣前經(jīng)0.45 μm膜過濾，進樣。

1.3.3 色譜條件 Zorbax Eclipse C18色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：v（甲醇）∶v（體積分數(shù)0.4%磷酸）=50∶50； 流量：1 mL/min； 檢測波長：360 nm；柱溫 35 ℃；進樣量 5 μL。

2 結(jié)果分析

2.1 線性關(guān)系考察

將對照品溶液從低濃度到高濃度，依次進樣，每個濃度進樣3次，每次5 μL，按1.3.3的色譜條件進行HPLC分析，以色譜峰面積（Y）對進樣量（X）進行回歸，計算回歸方程。結(jié)果見表1。

由表1看出，各對照品在一定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度實驗

精密吸取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素甙、槲皮素對照品質(zhì)量濃度分別為 0.48、0.55、0.54、0.58 mg/mL的對照品混合液5 μL，按照1.3.3的色譜條件進行HPLC分析。重復(fù)進樣6次，測定各個對照品的峰面積，結(jié)果蘆丁峰面積RSD為1.86%，金絲桃苷峰面積RSD為2.02%，異槲皮素甙峰面積RSD為2.35%，槲 皮素峰面積RSD為2.26%。表明儀器精密度良好。

表1 各對照品的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation and correlation coefficient of four standard samples

2.3 穩(wěn)定性實驗

精密吸取 1.3.2 的供試品溶液 5 μL，于 0、4、8、12、16、20、24、48 h 分別進樣， 測定蘆丁的峰面積RSD為1.91%，金絲桃苷峰面積RSD為2.18%，異槲皮素甙峰面積的RSD為2.81%，槲皮素峰面積RSD為2.32%。表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性實驗

精密稱取同一批羅布麻樣品6份，按照1.3.2的方法制備，1.3.3的色譜條件測定。結(jié)果顯示，蘆丁峰面積RSD為3.20%，金絲桃苷峰面積RSD為4.82%，異槲皮素甙峰面積RSD為 3.21%，槲皮素峰面積RSD為4.35%。表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 回收率實驗

精密吸取已知含量的羅布麻提取液，分成3組，每組按照低、中、高3個標準準確加入對照品混合液，按1.3.3的色譜條件測定。結(jié)果顯示蘆丁平均回收率99.1%，RSD為4.3%；金絲桃苷的回收率為91.7%，RSD為5.1%；異槲皮素甙的平均回收率為96.3%，RSD為 3.8%；槲皮素的平均回收率為115.2%，RSD為4.9%。

2.6 不同采收期羅布麻中黃酮含量測定

不同采收期的羅布麻樣品按1.3.2供試品溶液制備處理，在上述色譜條件下進行分析，HPLC圖譜見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，4種黃酮在所選擇的HPLC條件下能夠很好分開。羅布麻葉提取物中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素甙和槲皮素的出峰時間分別為 5.790、6.275、6.640、18.382 min。

圖1 對照品的HPLC色譜Fig.1 HPLC Chromatogram of standard samples

圖2 樣品（3#）中的HPLC色譜Fig.2 HPLC Chromatogram of flavonoids from sample（3#）

2.7 不同采收期羅布麻中黃酮含量比較分析

參照各對照品的標準曲線，求得不同采收期的羅布麻葉樣品中黃酮質(zhì)量分數(shù)，并進行柱狀圖分析。結(jié)果見表2和圖3。

圖3 不同采收期羅布麻中黃酮含量柱狀分析圖Fig.3 Columnar graph of flavonoids content of the Apocynum venetum samples gathered in different seasons

表2 不同采收期樣品中黃酮成分質(zhì)量分數(shù)Table 2 Flavonoids content of the Apocynum venetum samples gathered in different seasons

由圖3和表2可以看出，隨著月份增加，羅布麻中黃酮含量整體呈增加趨勢。這4種黃酮中，異槲皮素甙含量最高，其次是蘆丁。6月份采收的羅布麻葉中沒有檢測出金絲桃苷，8月份采收的羅布麻茶沸水泡制液中未見槲皮素，其他3種黃酮含量比較高，說明沸水泡制能很好地溶出黃酮類物質(zhì)。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

按照甲醇磷酸不同比例作為流動相進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相為v（甲醇）∶v（體積分數(shù)0.4%磷酸）=50∶50時，各組分峰分離較好，且峰形對稱性良好。在色譜柱允許的范圍內(nèi)，考察了溫度的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高分離效果越好。綜合考慮，選擇了50℃作為最佳柱溫。

3.2 提取條件的選擇

蘆丁和金絲桃苷、異槲皮素甙極性較大，槲皮素極性較小，溶于甲醇、乙醇、微溶于水。考察了不同提取溶劑，試驗結(jié)果表明體積分數(shù)60%乙醇溶液能夠兼顧這四種黃酮的極性特點，再加上乙醇作為溶劑的安全性，因此用體積分數(shù)60%乙醇溶液為提取溶劑。實驗同時也研究了沸水泡制羅布麻茶，對其黃酮的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沸水泡制能溶出大部分黃酮類成分。因此，羅布麻葉作為茶葉用沸水泡制是合理的，且沖泡3遍，基本能溶出大部分黃酮類成分。

3.3 采收季節(jié)確定

黃酮類是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物，隨著植物的生長而呈動態(tài)變化[16]。植物生長環(huán)境中的溫度、水分、光照、大氣、鹽分、養(yǎng)分等都會對植物的生長產(chǎn)生各種各樣的影響甚至脅迫，致使次生代謝產(chǎn)物發(fā)生變化[17]。從以上結(jié)果看出，8月份采收的羅布麻葉（葉片烏綠）含有的黃酮總量最多，但槲皮素含量甚微，可以用作加工成羅布麻茶。9月份采收的羅布麻葉（葉片呈金黃）金絲桃苷、槲皮素含量較高，可以作為羅布麻發(fā)酵茶或者羅布麻提取物的最佳原料。由此看出，研究不同采收季節(jié)羅布麻中黃酮含量，有利于更合理地利用羅布麻資源，創(chuàng)造更高的附加值。

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