高富硒酵母菌誘變選育研究

曾禮華， 馬平美， 李 維*， 黃崇波， 張 純，陳貴英， 葛方蘭， 唐 凌， 鄺聲耀

（1.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都610061；2.四川省畜科飼料有限公司，四川 成都610066）

世界衛生組織于1973年將硒確定為人和動物必需的微量元素，同年美國FDA批準亞硒酸鈉和硒酸鈉可作為飼料添加劑應用于動物養殖業。近年來，越來越多的研究揭示和驗證了硒的多種生理功能，主要包括：抗氧化作用[1-2]，增強免疫作用與抗病作用[3-5]，調節機體代謝[2]，另外，硒還能增強人和動物的生殖機能[6-7]，具有抗自由基，延緩衰老，拮抗有毒元素等作用[7]。

由于硒元素具有上述重要的生理功能，其作為機體必需的營養元素早就引起人們的高度重視[8-9]。目前，硒營養強化劑主要有3種即無機態亞硒酸鈉、有機態硒及富硒酵母，無機硒和有機硒化合物都能被動物機體吸收，但是，由于畜禽對無機硒吸收利用過程中，無機硒須先進入肝臟，轉化成生物硒后才可被吸收，因而毒性很大，而富硒酵母具有吸收性好、安全無毒等優點，是一種比較理想的硒營養劑[9]，已被用作營養強化劑應用到各種食品中，在預防和治療疾病以及養殖業等方面也有廣泛的應用[8-9]。我國20個省市中，缺硒、貧硒縣高達72%，全國近7億人口處于缺硒狀態，因此開發高富硒酵母具有重要的意義。

酵母硒是通過酵母自身的代謝活動，將無機硒在體內轉化為與蛋白質和多糖相結合的有機硒，提高了硒的利用率和安全性[10]。已有的研究結果表明，在酵母體內硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[9-10]。硒是硫的類似物，硒被生物同化吸收是利用S的代謝酶作用進入細胞，取代S整合到游離氨基酸和蛋白質中[9-10]，因而，無機硒鹽離子和無機硫酸酸根離子在吸收同化過程中競爭同一轉運系統。

國內已有多篇有關富硒酵母菌選育的報道[11-13]，但多采用單一誘變劑處理的方法，難以獲得理想的富硒酵母突變菌株。作者利用多種來源的酵母菌，先通過亞硒酸抗性篩選，選出硒耐受性和富硒能力強的酵母菌株，并以此為出發菌株，經亞硝基胍（NTG）、紫外線復合誘變，再分別結合亞硒酸抗性、乙硫氨酸抗性篩選，選育出高產富硒酵母菌株，旨在為酵母硒的產業化生產提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

由市農產品市場購買到的8種食用酵母粉和3種酒曲，作為菌株分離的樣品來源。另外，從中國工業微生物菌種保藏管理中心購買到10株食品安全級的酵母菌直接作為供試菌株，包括：2株熱帶假絲酵 母 （Candida tropicalis），2 株 釀 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae），2 株 產 朊 假 絲 酵 母（Candida utilis）， 其余葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）、異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、白球擬 酵 母 （Torulopsis candida）、 粟 酒 裂 殖 酵 母（Schizosaccharomyces pombe）各 1 株。

1.2 培養基

1.2.1 YEPD和YNB培養基 培養基的配制參照文獻[14-15]的方法，加1.8%的瓊脂即成固體培養基；

1.2.2 酵母菌分離培養基 （孟加拉紅培養基）配方 （g/L）：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀（K2HPO4·3H2O）1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，氯霉素 0.1 g；上述各成分加入蒸餾水中溶解后，再加孟加拉紅溶液（1%水溶液）3.3 mL。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培養基中，分裝后，121℃滅菌20 min；

1.2.3 亞硒酸鈉抗性篩選培養基 在YEPD培養基中加入一定濃度過濾滅菌的亞硒酸鈉溶液；

1.2.4 乙硫氨酸抗性培養基 在YNB培養集中加入一定量過濾滅菌的乙硫氨酸溶液。

1.3 試劑

3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）：Fluka 公司產品；亞硝基胍、DL-乙硫氨酸、硒代蛋氨酸標準品：Sigma公司產品。

1.4 菌種初篩

分別稱取食用酵母粉和酒曲樣品各2 g，加入到YEPD液體培養基中，30℃，靜置活化2 h，梯度稀釋，取0.2 mL稀釋涂布于酵母菌分離培養基上，30℃，培養24 h，挑取單菌落于斜面保存。

1.5 亞硒酸鈉抗性復篩

亞硒酸鈉溶液過濾除菌后，加入到滅菌的培養基中， 制備 Se4+含量分別為 0、10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的亞硒酸鈉抗性培養基。將分離獲得的酵母菌株及購買的10株菌活化后，制作菌懸液，分別取0.2 mL菌懸液，涂布于上述固體亞硒酸鈉抗性培養基上，30℃倒置培養，48 h后觀察。選出菌落較大，顏色較淺的酵母菌于斜面培養基進行純培養。從新鮮斜面上轉接于一環菌體于裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養，測其生物量和硒含量，篩選出生物量和硒含量較高的酵母菌株。

1.6 酵母中硒含量的測定

參照文獻[14-16]，采用 3，3’-二氨基聯苯胺比色法測定酵母細胞的總硒含量及無機硒含量，兩者之差即為酵母細胞內有機硒的含量。

1.7 菌體生物量的測定

取發酵菌液于4 000 r/min離心10 min，收集菌體，無菌水洗滌3次，65℃烘干至恒重后，稱量即得菌體生物量（g/L）。

1.8 氨基酸成分分析

樣品的氨基酸成分委托中國測試技術研究院測定。

1.9 菌種的誘變與篩選

1.9.1 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性篩選 取生長至對數期的酵母菌懸液，4 000 r/min離心，用生理鹽水洗滌數次，懸浮于檸檬酸緩沖液，細胞濃度調至107個/mL，加入0.5 mL亞硝基胍溶液，35℃振蕩處理1 h，其致死率為80%。加入生理鹽水稀釋終止反應，再用生理鹽水洗滌數次，懸浮于生理鹽水中。取適量上述菌液涂布于Se4+含量為80 μg/mL的亞硒酸鈉抗性平板中，避光培養48 h。

1.9.2 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性篩選 取生長至對數期的酵母菌懸液稀釋，涂布于乙硫氨酸質量濃度分別為 0.5、1、1.5、2、2.5、3 g/L 的 YNB 培養基上（每一個濃度梯度設2個平行實驗組），經48～72 h培養后，確定菌株的乙硫氨酸敏感性。

將前述誘變獲得的高產菌株培養至對數期，收集細胞，用無菌水稀釋成107個/mL。吸取6 mL菌懸液于直徑為9 cm的無菌平板中，將平皿置于紫外誘變箱中，使無菌平板距離紫外燈管25 cm左右，經紫外燈照射60 s，致死率為80%。將經上述紫外線誘變處理后的菌液適當稀釋，涂布于乙硫氨酸抗性平板上，避光培養48 h。

2 結果與討論

2.1 亞硒酸鈉抗性菌株篩選

從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離獲得26株菌株，加上作者所在實驗室購買并保存的10株酵母菌，共計36株。對該36株酵母菌進行亞硒酸鈉抗性篩選，獲得3株能在Se4+質量濃度為80 μg/mL的平板上生長的菌株。研究表明，在Se4+質量濃度低于20 μg/mL的平板上，各個菌株與對照組相比，生長狀況無明顯差異。Se4+質量濃度大于20 μg/mL時，有的菌株生長開始受阻；當Se4+質量濃度達到40 μg/mL時，有14株能正常生長；當Se4+質量濃度達到80 μg/mL時，不同酵母菌株生長差異十分明顯，36株供試菌中僅有3株能正常生長，它們分別是釀酒酵母A1-2，熱帶假絲酵母1254，產朊假絲酵母Y-3，當 Se4+質量濃度高達 100 μg/mL時，所有菌株均不能正常生長。對該3株菌株分別進行復篩，測定其生物量、總硒質量分數、無機硒質量分數，計算有機硒質量分數及轉化率，結果見表1。

表1 亞硒酸鈉抗性菌株的篩選Table 1 Screening of sodium selenite-resistant strains

由表 可見，熱帶假絲酵母菌株 的生物量、有機硒含量及有機硒轉化率均最高，分別為4.1 g/L、521.99 μg/g、73.26%。故選擇熱帶假絲酵母菌株1254作為誘變育種的出發菌株。

2.2 亞硝基胍誘變及亞硒酸鈉抗性株的篩選

出發菌株熱帶假絲酵母菌1254經亞硝基胍誘變后，涂布亞硒酸鈉抗性平板篩選，以菌落大小和顏色特征為指標，挑出菌落較大顏色較淺的株菌，依次編號。將各菌株接種在 Se4+質量濃度為80 μg/mL的液體培養基中進行發酵培養，測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質量分數，計算有機硒的質量分數及轉化率。共計挑出12株菌落較大、顏色較淺的菌株，進行發酵培養，獲得總硒質量分數、有機硒質量分數及有機硒轉化率均最高的菌株1254-6，與出發菌株對比如表2。

表2 出發菌株1254和化學誘變株1254-6的生物量及硒質量分數Table 2 Biomass and selenium content of the parental strain 1254 and mutant 1254-6

由表2可見，與出發菌株1254相比，誘變菌株1254-6的生物量降低了13.17%，但誘變菌株1254-6的總硒質量分數、有機硒質量分數及有機硒轉化率分別是出發菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍，故選取菌株1254-6作為下一輪誘變育種的材料。

2.3 紫外線誘變及乙硫氨酸抗性菌株篩選結果

2.3.1 乙硫氨酸抗性分析 將菌株1254-6活化后稀釋，涂布于一定乙硫氨酸濃度梯度的YNB培養基上，經48～72 h培養后，觀察其生長情況。結果顯示，與大多數酵母菌相似，該菌株在乙硫氨酸質量濃度為1.0 g/L的平板上，不能正常生長。因此選擇乙硫氨酸質量濃度為1.0 g/L作為誘變抗性的篩選質量濃度。

2.3.2 乙硫氨酸抗性株的篩選 1254-6菌株經紫外誘變處理，菌懸液稀釋涂布于含1.0 g/L乙硫氨酸的YNB平板上，避光培養72 h。挑選生長快，菌落較大，顏色較淺的抗性菌株共37株，編號為1254-6-1到1254-6-37。將其點樣于含乙硫氨酸的平板上，培養48～72 h，每組設3個平行實驗組。根據菌落大小及生長情況選取16株菌株，在發酵培養集中進行富硒培養，測定菌株的生物量、總硒量、無機硒質量分數，計算有機硒質量分數及轉化率。其中菌株1254-6-1含硒量最高的，結果如表3所示。

表3 菌株1254-6-1生物量及硒質量分數Table 3 Biomass and selenium content of mutant 1254-6-1

由表3可見，與菌株1254-6相比，菌株1254-6-1的生物量、總硒質量分數、有機硒質量分數及有機硒轉化率分別提高了2.13倍、1.20倍、1.21倍、1.01倍。與原始出發菌株1254相比，雙抗菌株1254-6-1的生物量、總硒質量分數、有機硒質量分數及轉化率分別提高1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍，分別達到 7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。

出發菌株1254經亞硝基胍誘變處理，顯著提高了菌株總硒質量分數、有機硒質量分數及有機硒轉化率，但降低了菌株生物量。出發菌株1254經亞硝基胍誘變處理后，再采用紫外線誘變處理，結果獲得的菌株生物量得以明顯提高，總硒質量分數、有機硒質量分數及有機硒轉化率也得以改善。由此可見，采用不同誘變劑處理，可以減少單一誘變劑的負突變，實現正突變的累加，從而提高育種效率。

2.4 突變菌株氨基酸含量分析

利用氨基酸自動分析儀對雙抗性株1254-6-1與出發株1254氨基酸的質量分數進行測定，結果見表4。

表4 誘變株1254-6-1與出發株1254氨基酸質量分數Table 4 Content of amino acids of mutant 1254-6-1 and the parental strain 1254

由表4可知，經過連續誘變及兩種抗性平板的反復篩選得到的菌株1254-6-1，各種氨基酸的相對質量分數均高于出發菌株，其中蛋氨酸是出發株的135%，胱氨酸是194.1%，從代謝途徑來可知，胱氨酸為蛋氨酸的合成提供巰基，說明合成前體物含量的增加可造成蛋氨酸的增加。有前人研究結果可知，在酵母體內硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸形式存在[8-9]，因此由此推測，半胱氨酸和蛋氨酸含量的變化與酵母體內硒含量是呈正相關性的。此外，與出發菌株相比，誘變后菌株中酪氨酸的含量也有較大提高，是出發菌株的140%。酪氨酸用途很廣泛，在醫藥上用作甲狀腺功能亢進，也可作為食品添加劑。另外酪氨酸還是一種重要的生化試劑，是合成多肽類激素、抗生素、L-多巴等藥物的主要原料。廣泛用于農業科學研究，也作飼料添加劑和配制人工昆蟲飼料。

3 結語

從8種食用酵母粉和3種酒曲中分離得到26株酵母菌菌株，連同由中國微生物菌種保藏中心提供的10株酵母菌，共36株菌。通過對該36株酵母菌進行硒耐受性初篩和搖瓶發酵富硒復篩，獲得1株硒耐受性高且富硒能力較強的熱帶假絲酵母菌株1254。對菌株1254進行了多輪誘變選育。通過亞硝基胍誘變，亞硒酸鈉抗性篩選后，獲得了12株抗性菌，其中突變菌株1254-6的總硒質量分數、有機硒質量分數及有機硒轉化率分別是出發菌株1254的6.59倍、7.72倍、1.17倍。突變菌株1254-6經紫外誘變和乙硫氨酸抗性篩選后，獲得了乙硫氨酸抗性菌株37株，其中突變菌株1254-6-1的生物量、總硒質量分數、有機硒質量分數及轉化率分別達到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%。 對雙抗性株1254-6-1與出發株1254氨基酸的相對質量分數分別進行測定，結果顯示，雙抗性株1254-6-1的各種氨基酸含量均高于出發菌株1254，其中蛋氨酸是出發株的135%，胱氨酸是194.1%。

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