紅樹植物內生真菌的分離鑒定及抗菌活性菌株的篩選＊

陳昭華，伍 菱，楊秋明，王驥妍，朱敏佳，杜希萍，2，3，4

(1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門 361021;3.福建省高校食品微生物與酶工程技術研究中心，福建廈門 361021;4.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建廈門 361021)

內生真菌(endophyte)是指生活于健康植物組織內部、不引發植物產生明顯病癥的一類真菌。不但對促進宿主植物的生長發育，增強抗逆性起到重要作用，而且許多內生真菌能產生與宿主相同或相似的生物活性物質［1-2］。目前已從植物內生真菌中發現多種具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗菌、殺蟲、免疫抑制、酶抑制劑或激活劑等活性代謝產物，在醫藥業、農業的生物防治方面都顯示出重要的應用價值［3-6］。

紅樹植物(mangrove)是熱帶和亞熱帶潮間帶木本植物群落，通常生長在港灣河口地區的淤泥灘涂上，是海灘上特有的森林類型和重要的生態系統。由于所處的高溫、高鹽、頻繁潮汐、缺氧、強風、強紫外線的獨特的生存環境，致使其內生真菌次級代謝產物結構類型豐富多樣且具有不同的生物活性［7-8］，是許多具有各種活性的先導化合物的重要來源之一。

本文從福建省廈門市集美區紅樹植物無瓣海桑(Sonneratia apetala)，海 馬 齒 (Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)的根、莖、葉中分離培養其內生真菌，并對其進行形態鑒定，了解紅樹植物內生真菌在不同植物和不同器官上的分布情況;同時針對多種指示菌進行抗菌活性測試，從中篩選出具有抗菌活性物質的產生菌，為藥用微生物資源的研究、開發和利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無瓣海桑(Sonneratia apetala)，海馬齒(Sesuvium portulacastrum)和秋茄(Kandelia candel)3種紅樹植物的根、莖、葉采集自福建省廈門市集美紅樹林區。

1.1.2 培養基 (1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA) 4%PDA培養粉，20%海水，2%瓊脂，121℃滅菌20 min。(2)牛肉膏蛋白胨培養基 1%蛋白胨，0.5%牛肉膏，0.5%NaCl，2%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 供試指示菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。

1.2 方法

1.2.1 紅樹內生真菌的分離與純化 采用組織塊法進行分離［9］。將采集的根、莖、葉在水中沖洗干凈，瀝干水分。將莖用無菌刀片去除外皮層和木質部，取內皮層及韌皮部;根去除外皮。用無菌刀片將上述樣品切成5 mm×5 mm的小塊，依次用75%乙醇溶液浸泡振蕩30 s，2%次氯酸鈉溶液浸泡振蕩3 min進行表面消毒，無菌水沖洗3遍，無菌濾紙吸干表面無菌水。將表面消毒后的組織塊置于含有終濃度為50 mg/L慶大霉素的PDA平板上，28℃倒置培養。待培養基出現菌落，挑取邊緣菌絲接種于新的PDA培養基上，連續純化幾代，得到純化菌株。

1.2.2 菌種鑒定 按照《真菌鑒定手冊》的方法，將純化菌株接種到PDA培養基，28℃培養，定期觀察并記錄菌落形狀、大小、表面質地、生長速度、是否產色素等，同時挑取邊緣菌絲于載玻片，在顯微鏡下觀察其菌絲特征及分枝情況、孢子和產孢器結構［10］，并參考《中國真菌志》［11］進行菌株的分類鑒定。

1.2.3 抗菌活性測定 用菌餅法測定內生真菌的抗菌活性［12-13］。用直徑0.6 cm的打孔器在28℃生長14 d(PDA培養基培養)的內生真菌菌落邊緣制備菌餅，然后分別將菌餅置于含金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌的牛肉膏蛋白胨培養基平板(指示菌菌懸液的終濃度為105CFU/mL)上，每株內生真菌對3種指示菌分別作2次重復。制好后的培養皿于37℃恒溫培養1 d后觀察，測其抑菌圈的大小。

2 結果與分析

2.1 紅樹植物內生真菌的分離結果

從采集到的紅樹植物無瓣海桑、海馬齒、秋茄中共分離得到25株內生真菌(表1)。從表1可以看出，從無瓣海桑中分離得到的3株菌株全部來自于葉片。海馬齒中由葉分離出5株，占總菌株數的56%，比例最高;其次是由莖分離出3株，占總數的33%;由根分離出1株，占總數的11%。而秋茄中分離得到比例最高的部位是根，分離到6株，占總數的46.15%;其次為葉片，分離出5株菌株，占總數的38.46%;由莖部分離到2株，占總數的12.38%。由此可見，不同植物和不同部位上分離到的內生真菌菌株數量有較為明顯的差別。

表1 紅樹植物內生真菌的分離結果Tab.1 The result of endophytic fungi from mangrove plants

2.2 紅樹植物內生真菌的種屬分布

本次分離得到的25株內生真菌，根據形態觀察及分類結果初步鑒定，其中鏈格孢屬7株，曲霉屬6株，根霉屬3株，長蠕孢屬2株，紅曲霉屬2株，枝頂孢霉屬2株，鐮孢屬1株，待定2株，其具體的種屬分布情況見表2。

從表中可以看出:紅樹植物內生真菌有一定的種屬多樣性，以鏈格孢屬和曲霉屬為主，分別占菌株總數的 28.0% 和 24.0% 。

表2 內生真菌的種屬分布Tab.2 The groups of endophytic fungi

2.3 抗菌活性內生真菌的篩選

表3 內生真菌抗菌活性的篩選Tab.3 Screening of endophytic fungi with antibacterial activities

表4 內生真菌抗菌活性的篩選Tab.4 Screening of endophytic fungi with antibacterial activities

采用菌餅法對分離到的紅樹植物內生真菌進行抗菌活性測定，指示菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌，結果如表3和表4所示。在分離到的25株內生真菌中，有19株菌株對至少一種指示菌有抑制作用，占分離菌株總數的76.0%;其中對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌有抑制作用的分別有11株、15株、14株，分別占分離菌株總數的 44.0%、60.0%、56.0%。有13株菌株可抑制兩種或三種指示菌，占分離菌株總數的52.0%;其中菌株 BY1、BJ3、BJ1、WY3、QJ4、QG5、QY1和QY2對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏桿菌同時有抑制作用;QJ3對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌同時有抑制作用;BY、WY1、QE2和QJ1對枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏桿菌同時有抑制作用。菌株BY1、BY2、QY1和QY2對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(20 mm﹤抑菌圈≦30 mm)，其抑菌圈分別為 22.5 mm、20.5 mm、24.5 mm 和24.5 mm;菌株 BY4、BJ3、BJ1、WY3、QJ3、QJ4 和 QG5對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱(10 mm﹤抑菌圈≦20 mm)。菌株 WY3、QE1、和 QJ4對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(30 mm﹤抑菌圈≦40 mm)，其抑菌圈分別為 34.0 mm、33.0 mm 和 32.0 mm;菌株QY1對大腸埃希氏桿菌的抑制作用最強(30 mm﹤抑菌圈≦40 mm)，其抑菌圈為30.5 mm。由此可見，紅樹植物中存在著豐富的具有較強的抗菌活性和廣譜的抗菌作用的內生真菌。

3 討論

植物內生真菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的廣度和深度，又有多方面的應用潛力，是個潛力巨大、尚待開發的微生物新資源［14］。紅樹植物根、莖、葉中生長著豐富的內生真菌，本文共分離到25株菌，其中，從莖和葉中分離到的內生真菌數量較多，占總菌株數的72.0%。地上部分的含菌數高于地下部分，可能是由于植物在其根際會釋放出某些化學物質，抑制了根際微生物生長的緣故，也可能是由于光合作用的產物較多的集中于葉以及莖中，未能良好的向根部傳遞。紅樹植物內生真菌的種屬分布和抗菌活性篩選實驗表明，紅樹植物內生真菌不僅種屬分布廣泛，而且具有良好的抗菌活性，是尋求抗菌藥物的寶貴資源。HPLC分析也發現，這些具有抗菌活性內生真菌的次生代謝產物類型豐富，采用活性跟蹤法對其抗菌活性化合物的分離純化和結構鑒定正在進一步進行中。

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