福建省部分地區(qū)馬鈴薯致病疫霉群體遺傳多樣性分析＊

祝 雯，付海靜，楊麗娜，陳慶河，翁啟勇，詹家綏*

(1.福建農(nóng)林大學植物病毒研究所，福建福州 350002;2.福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，福建福州 3500013)

病原物致病性或寄主的抗病性是指在特定時間、地理條件下某一特定的病原物群體同某一特定的寄主之間的關(guān)系［1］。植物病原物群體結(jié)構(gòu)的變化直接影響著植物病害的發(fā)生和流行。通過對病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究，推測病原物的進化機制，從而有針對性選擇病害防治手段，為最終實現(xiàn)延長抗性品種使用壽命、降低植病防治的環(huán)境和生態(tài)成本及可持續(xù)性植病防治奠定基礎(chǔ)［2］。在二十世紀80年代之前，致病疫霉遺傳多樣性低，群體結(jié)構(gòu)比較單一。從對來自20個國家的300多個疫霉菌株進行同功酶和脫氧核糖核酸指紋鑒定發(fā)現(xiàn)，交配型為A1的USA-1基因型占絕對優(yōu)勢［3］。自1984年首次在歐洲檢測到A2交配型后［4］，A2交配型又先后在許多國家發(fā)現(xiàn)。A2的出現(xiàn)意味著可以產(chǎn)生卵孢子，并通過有性繁殖進行基因重組，形成新的適應(yīng)性更強的菌株［5-6］。在歐洲北部地區(qū)及墨西哥部分地區(qū)馬鈴薯致病疫霉菌群體結(jié)構(gòu)日趨復雜［3，7-9］。在中國自從1996年報道A2交配型首次在中國河北發(fā)現(xiàn)，人們逐漸開始關(guān)注我國致病疫霉菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)，陸續(xù)報道了該病原物在部分省市地區(qū)的群體遺傳多樣性［10-20］。但其中所涉及的群體菌株大都來自2008年以前。

晚疫病是限制我國馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素，在我國4個栽培區(qū)域即北方一季作區(qū)、中原二季作區(qū)、南方冬作區(qū)、西南混作區(qū)均有發(fā)生。福建省屬于南方冬作區(qū)，近年來晚疫病在福建省的發(fā)生和流行日趨嚴重。本文分析福建省福州市、長樂市和漳州市三個地區(qū)的馬鈴薯致病疫霉菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征，明確馬鈴薯致病疫霉遺傳多樣性的空間分布，以探索其可能的形成機制。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集及病菌的分離培養(yǎng)、保存

2010年3月-4月福建省馬鈴薯晚疫病流行期，在發(fā)病區(qū)任選一塊田塊，隨機選擇發(fā)病植株，病株間隔2米以上，每個病株上選擇單個病斑的病葉。無菌水沖洗葉片表面后，保濕培養(yǎng)12～24 h。用接種針挑取單根菌絲，接種于含有抗生素(氨芐青霉素100 mg/L;利福平10 mg/L)的選擇性黑麥培養(yǎng)基上，黑麥培養(yǎng)基配置是將20 g黑麥種子浸泡12 h，勻漿機粉碎，60℃水浴浸提3 h，四層紗布過濾，濾液定容至1 L，121℃高壓20 min。18℃避光培養(yǎng)7～10 d。純化的菌株接種于黑麥培養(yǎng)基培養(yǎng)，13℃避光長期保存菌株。

1.2 馬鈴薯晚疫病菌基因組DNA的提取和SSR分析

收集在黑麥液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d的菌絲體，冷凍干燥并粉碎后使用TAKARA公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒提取基因組 DNA。選用 8 對引物 Pi02、Pi04、Pi16、Pi26、Pi56、Pi66、Pi33［21］，Pi4B［22］，按 照 Lees 等 報 道 的 的 方法［21］擴增基因組 DNA，25μL 反應(yīng)體系，模板 1μL DNA，1.0 unit Taq DNA polymerase，200 mmol/L dNTP，10 pmol/L 引物，2.5 mmol/L MgCl2，加無菌超純水補足至25μL。PCR熱循環(huán)條件為:95℃預變性2 min;95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)33次;72℃延伸5 min。擴增反應(yīng)在PCR擴增儀(AB 2720 Thermal Cycler)上進行。PCR產(chǎn)物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染方法［23］為將膠塊放入含有0.1%硝酸銀，10%乙醇的染色液中染色5 min，顯影劑(2%NaOH，0.5%甲醛，甲醛為臨用前加入)顯色，100 r/min搖動10～15 min，充分染色至條帶明顯。

1.3 統(tǒng)計與分析

不同SSR引物的擴增結(jié)果視為不同的基因座，同一引物的不同擴增片段視為不同等位基因。菌株的基因型按每一基因座的等位基因種類進行劃分，相同基因型的菌株是指它們的8個基因座都含有完全一致的等位基因。群體內(nèi)的遺傳多樣性同時用基因座間的平均觀察雜合度和平均期望雜合度來衡量。每個基因座的觀察雜合度等于該基因座雜合體占群體內(nèi)所有個體的比例。每個基因座的Nei氏遺傳多樣性用期望雜合度來衡量［24］。群體間遺傳結(jié)構(gòu)的差異性則分別用Nei氏遺傳距離［25］、Nei氏遺傳相似度［25］，列表卡方［26］和群體間遺傳分化程度(FST)來衡量［27］。當具有不同等位基因頻率的亞群體混合時，混合群體的平均雜合度會減低，即使亞群本身處于哈迪-溫伯格平衡，而平均雜合度會減低程度與群體間遺傳分化程度成正相關(guān)［27］，用數(shù)學公式表示為:

在公式(1)中，F(xiàn)IT為總?cè)后w偏離哈迪-溫伯格的程度，而FIS則是亞群體內(nèi)的平均偏離哈迪-溫伯格平衡的程度。如果繼續(xù)假設(shè)亞群體間的基因流和遺傳漂變已處于相對平衡階段，則根據(jù)島嶼模式，群體間單一世代的平均有效基因流量(Nm)可以用混合群體的平均雜合度會減低程度來估算，用公式表示為:

等位基因頻率、基因多樣性，群體間的遺傳距離及相似度，群體間遺傳分化程度及基因流量等群體遺傳學參數(shù)用 POPGENE321.32版軟來估算［28］。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉菌的分離

2010年3月-4月從福建省長樂、漳州和福州三地采集的病葉中共分離得到95株馬鈴薯致病疫霉菌株，菌株的采集地和各地采集的菌株數(shù)及寄主詳見表1。

表1 福建省晚疫病菌株采集Tab.1 Number of P.infestans isolates collected from 3 fields in Fujian province

2.2 SSR位點多態(tài)性分析

在95個菌株中，8個SSR引物(基因座)總共檢測出21個等位基因，平均每個基因座檢測出2.63個等位基因。每個基因座可檢測到至少2個等位基因。Pi02和Pi26基因座均檢測出4個等位基因。群體內(nèi)每個基因座的等位基因頻率見表2。列表卡方檢驗表明在8個基因座中，有5個基因座的等位基因頻率差異極顯著(P＜0.001)。

2.3 基因型結(jié)構(gòu)分析

95個菌株中共檢測出26種基因型，分別編號為F1-F26(圖1)，其中13種基因型只出現(xiàn)1次，4種基因型出現(xiàn)過2次。除了F7、F13和F16在兩個地區(qū)(漳州和福州)同時發(fā)現(xiàn)外，其它的基因型都只在一個地區(qū)出現(xiàn)。在長樂市的致病疫霉中，有6種SSR基因型，其中F3為主要基因型，占長樂群體的70.8%。在漳州市的菌株中共鑒定出11個基因型，其中的F13的比例為32.1%。在福州市的菌株中，鑒定出12種基因型，其中F-24基因型占18.6%。F3、F13、F24分別為長樂、漳州和福州的最高頻率基因型，其基因型組成結(jié)構(gòu)至少差兩個等位基因(表3)。

表2 致病疫霉8個基因座等位基因頻率Tab.2 Allelic frequencies of eight microsatellite loci in the three P.infestans populations sampled from Fujian province

圖1 馬鈴薯晚疫病菌SSR基因型的地理分布和頻率Fig.1 Frequency and geographicaldistribution of P.infestans genotypes in Fujian province

表3 主要的SSR基因型組成Tab.3 Allelic composition of the most common P.infestans isolates in Fujian province

三個群體的純合度的觀測值均小于期望值，而雜合度的觀測值均大于期望值(表4)，漳州和福州的遺傳差異最小，遺傳距離為0.10，而長樂與和福州和漳州的差異較大，遺傳距離分別為0.53和0.31(表5)。三地區(qū)的致病疫霉菌群體平均群體遺傳分化度 FST 為 0.22，基因流 0.87。

表4 福建3個致病疫霉群體的遺傳變異度Fig.4 Genetic variation on the three populations of P.infestans from Fujian Province

表5 福建3個地區(qū)致病疫霉菌群體間的遺傳距離及相似度Fig.5 Pairwise comparisons of genetic distance and genetic identity among three populations of P.infestans from Fujian

3 討論

了解植物病原物群體遺傳結(jié)構(gòu)和進化規(guī)律對經(jīng)濟、有效和持久的病害控制十分重要。RAPD、RFLP，AFLP，SSR在進化過程不受或很少受自然選擇的影響，通過對這些基因型的群體遺傳分析，除了可以了解群體結(jié)構(gòu)的變化及遺傳多樣性外，還可以了解致病疫霉的起源中心、傳播途徑或遺傳遷移等［14，28-30］。SSR為共顯性標記，而且具有多態(tài)性頻率高，重復性好等優(yōu)點。國內(nèi)外學者主要采用 Lees等［21］和Knapova等［22］開發(fā)的SSR引物來分析研究馬鈴薯晚疫病菌的遺傳遺傳結(jié)構(gòu)。本研究選用文獻［21-22］報道的8對SSR引物測定2010年福建省福州、長樂和漳州三個點的致病疫霉的基因型組成和分布。趙志堅等對來自云南省的235個晚疫病菌菌株的多樣性，共檢測到8個等位基因，18個不同的 SSR基因型［20］。姚國勝等測定了中國部分地區(qū)66個馬鈴薯晚疫病菌菌株SSR基因型，共產(chǎn)生了7種SSR基因型［20］。Han等分析了甘肅2007年的85個馬鈴薯致病疫霉菌株，檢測到26個基因型［15］。本研究在95個菌株中共檢測出21個等位基因，26種基因型，而且一半的基因型只出現(xiàn)一次，在長樂樣本中檢測到6種SSR基因型，在漳州市和福州市的樣本中，分別檢測出11和12個基因型，說明福建致病疫霉群體遺傳的遺傳多樣性高。福建是馬鈴薯種署輸入省，除了農(nóng)戶自留種，每年都從北方和周邊主產(chǎn)區(qū)調(diào)入大量的種薯。在調(diào)入種薯的同時，一些新的致病疫霉基因型也跟著被帶進福建，這也許可以解釋為什么福建馬鈴薯種植面積較小，但致病疫霉群體的遺傳多樣性相對較高。

三個群體存在較大的等位基因頻率的差異。在8個基因座中，有5個基因座存在極顯著的群體間等位基因頻率的差異(表2)，同時群體間的Nei氏遺傳相似度系數(shù)最低在0.59，最高為0.91(表5)，群體遺傳分化系數(shù)則平均高達0.22。如果我們假設(shè)來自福建三個地區(qū)的亞群體間處于基因流和遺傳漂變平衡階段，則根據(jù)島嶼模式(island model)，我們可以算出群體間單一世代的平均有效基因流量(Nm)小于1，也就是說，在本研究采集的三個地區(qū)，平均每一繁殖時代只有少于一個的繁殖體從一個地區(qū)流向另一個地區(qū)，并成功地在當?shù)囟ㄖ埠头毖堋Ｔ诨蛐头矫妫齻€群體也存在較大的反差，相同的基因型(F7、F13和F16除外)極少在2個或2個以上地區(qū)發(fā)現(xiàn)，而且不同地區(qū)有各自不同的優(yōu)勢基因型。在長樂群體中，優(yōu)勢基因型為F3，占該群體的七成以上，而在漳州的優(yōu)勢基因型分別為F13，占該群體的三層以上，而福州的最高基因型F24的頻率不到二成(圖2)，而且三地區(qū)優(yōu)勢基因型的結(jié)構(gòu)至少差兩個等位基因(表3)。所以，它們由同一個基因型突變而成的可能性較低。進化理論認為地區(qū)間隔是導致群體間遺傳分化的重要原因，當?shù)貐^(qū)間隔阻礙亞群體間的基因流，位于不同地理區(qū)域的亞群體因持續(xù)的遺傳漂變使中性變異的頻率差距不斷加劇，導致非適應(yīng)性的群體遺傳分化。致病疫霉的孢子囊可以遠距離傳播［30］，而長樂、福州和漳州之間的沒有高山或大海等自然屏障，兩兩直線距離也不超過300公里，孢子囊很容易直接或通過達石(Step-stone)方式從一個地區(qū)傳到另一個地區(qū)。因此，我們認為福建三個致病疫霉菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)差異不是由于地理間隔造成的，而是由于不同地區(qū)使用不同起源的種薯。長樂市所種植的種薯來自于內(nèi)蒙古，漳州的種薯來自于農(nóng)戶的自留種，而福州種薯是來自全國等地提供的進行冬作馬鈴薯區(qū)試驗的不同品種。F13在漳州和福州同時出現(xiàn)卻占有相當高的比例也可能是因為種薯帶菌造成的，雖然漳州用的是自留種，其原始來源可能是參與福州冬作馬鈴薯區(qū)試驗的地區(qū)之一。

三個群體純和度的觀測值均小于期望值，而雜合度的觀測值均大于期望值(表4)，表明在福建有性繁殖在馬鈴薯晚疫病的流行和致病疫霉的進化中起的作用還不大，主要以無性繁殖為主，這和其它國家尤其是北歐的研究結(jié)果相差較大［9］。在北歐地區(qū)的瑞典晚致病疫霉菌在夏天形成卵孢子，形成大量新的基因型。

目前我國致病疫霉群體遺傳研究多局限于對遺傳多樣性的簡單描述，對遺傳多樣性形成的遺傳機制較少探討，這為系統(tǒng)分析和探討該病原物的進化機理和可持續(xù)性馬鈴薯晚疫病控制帶來一定困難。本研究利用分子生物學和群體遺傳學理論，初步分析了我國福建致病疫霉菌的群體遺傳多樣性和其形成的可能機制。但本研究樣本量較小，樣本的空間來源比較窄，下一步將對來之我國不同生態(tài)區(qū)的致病疫霉群體進行更廣泛全面的評估和分析，在全國范圍內(nèi)探討該病原物的群體遺傳結(jié)構(gòu)和進化機制，為制定長效和生態(tài)友好型的晚疫病防治措施提供科學依據(jù)。

［1］REGOES R R，NOWAK M A，BONHOEFFER S.Evolution of virulence in a heterogeneous host population［J］.Evolution，2000，54(1):64-71.

［2］祝雯，詹家綏.植物病原物群體遺傳學［J］.遺傳，2012，34(2):157-186.ZHU Wen，ZHAN Jiasui.Population genetics of plant pathogens［J］.Hereditas，2012，34(2):157-186.

［3］GOODWIN S B，COHEN B A，F(xiàn)RY W E.Panglobal distribution of a single clonal lineage of the Irish potato famine fungus［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(24):11591-11595.

［4］HOHL H R，ISELIN K.Strains of Phytophthora infestans from Switzerland with A2 mating type behaviour［J］.Transactions of the British Mycological Society，1984，83(4):529-531.

［5］LEVIN A，BAIDER A，RUBIN E，et al.Oospore formation by Phytophthora infestans in potato tubers［J］.Phytopathology，2001，91(6):579-585.

［6］FRY W E.Phytophthora infestans:the plant(and R gene)destroyer［J］.Mol Plant Pathol，2008，9(3):385-402.

［7］WIDMARK A K，ANDERSSON B，CASSEL-LUNDHAGEN A，et al.Phytophthora infestans in a single field in southwest Sweden early in spring:symptoms，spatial distribution and genotypic variation［J］.Plant Pathol，2007，56(4):573-579.

［8］FLIER W G，KROON L P N M，HERMANSEN A，et al.Genetic structure and pathogenicity of populations of Phytophthora infestans from organic potato crops in France，Norway，Switzerland and the United Kingdom［J］.Plant Pathol，2007，56(4):562-572.

［9］BRURBERG M B，ELAMEEN A，LEV H，et al.Genetic analysis of Phytophthora infestans populations in the Nordic European countries revealshigh genetic variability［J］.Fungal Biol，2011，115(4):335-342.

［10］GUO J，VAN DER LEE T，QU D Y，et al.Phytophthora infestans isolates from Northern China show high virulence diversity but low genotypic diversity［J］.Plant Biol，2009，11(1):57-67.

［11］LI B J，CHEN Q H，LV X，et al.Phenotypic and genotypic characterization of Phytophthora infestans isolates from China［J］.J Phytopathol，2009，157(9):558-567.

［12］趙志堅，曹繼芬，李燦輝，等.云南致病疫霉交配型、甲霜靈敏感性、mtDNA單倍型及其群體演替研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2007，40(4):727-734.ZHAO Zhijian，CAO Jifen，LI Canhui，et al.Characteristics of mating type，metalaxyl sensitivity，mtDNA haplotype and succession of Phytophthora infestans populations in Yunnan［J］.Scientia Agricultura Sinica，2007，40(4):727-734.

［13］朱小瓊，王英華，國立耘.中國不同地區(qū)致病疫霉遺傳多樣性的RAPD分析［J］.植物病理學報，2006，36(3):249-258.ZHU Xiaoqiong，WANG Yinghua，GUO Liyun.Genetic diversity revealed by RAPD analysis among isolates of Phytophthora infestans from different locations in China［J］.Acta Phytopathologica Sinica，2006，36(3):249-258.

［14］GUO L，ZHU X Q，HU C H，et al.Genetic structure of Phytophthora infestans populations in China indicates multiple migration events［J］.Phytopathology，2010，100(10):997-1006.

［15］HAN M，LIU G，LI J P，et al.Phytophthora infestans field isolates from Gansu province，China are genetically highly diverse and show a high frequency of self fertility［J］.J Eukaryot Microbiol，2012，60(1):79-88.

［16］吳婧蓮，楊志輝，秦宇軒，等.河北省番茄上致病疫霉Phytophthora infestans群體結(jié)構(gòu)的分析［J］.菌物學報，2010，29(4):508-517.WU Jinglian，YANG Zhihui，QIN Yuxuan，et al.Population structure of Phytophthora infestans on tomato in Hebei Province［J］.Mycosystema，2010，29(4):508-517.

［17］趙志堅，曹繼芬，楊明英，等.用兩個微衛(wèi)星標記分析云南馬鈴薯晚疫病菌的遺傳多樣性［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41(11):3610-3617.ZHAO Zhijian，CAO Jifen，YANG Mingying，et al.Genetic diversity of Phytophthora infestans of potato in Yunnan based on two microsatellite(SSR)markers［J］.Scientia Agricultura Sinica，2008，41(11):3610-3617.

［18］呂新，蘭成忠，李本金，等.福建致病疫霉(Phytophthora infestans)群體遺傳多樣性分析［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2008，23(2):149-153.LV Xin，LAN Chengzhong，LI Benjing，et al.Genetic diversity among population of Phytophthora infestans in Fujian province［J］.Fujian Journal of Agricultural Sciences，2008，23(2):149-153.

［19］姚國勝，楊志輝，朱杰華，等.中國部分地區(qū)馬鈴薯寄主上致病疫霉 SSR基因型分析［J］.菌物學報，2009，28(2):275-282.YAO Guosheng，YANG Zhihui，ZHU Jiehua，et al.SSR genotypic analysis of Phytophthora infestans from potato in some areas of China［J］.Mycosystema，2009，28(2):275-282.

［20］楊志輝，朱杰華，張鳳國.中國馬鈴薯晚疫病菌AFLP遺傳多樣性分析［J］.菌物學報，2008，27(3):351-359 YANG Zhihui，ZHU Jiehua，ZANG Fengguo.Genetic diversity of Chinese isolates of Phytophthora infestans revealed by AFLP analysis［J］.Mycosystema，2008，27(3):351-359.

［21］LEES A K，WATTIER R，SHAW D S，et al.Novel microsatellite markers for the analysis of Phytophthora infestans populations［J］.Plant Pathology，2006，55(3):311-319.

［22］KNAPOVA G，GISI U.Phenotypic and genotypic structure of Phytophthora infestans populations on potato and tomato in France and Switzerland［J］.Plant Pathol，2002，51(5):641-653.

［23］李本金，黃燦強，陳昌盛，等.晚疫病菌基因組SSR擴增產(chǎn)物兩種檢測方法的比較與改進［J］.生物技術(shù)通報，2010，11(2):171-176.LI Benjin，HUANG Canqiang，CHEN Changsheng，et al.Comparison and improvement of two methods for detection of Phytophthora infestans genomics SSR amplified fragments［J］.Biotechnology Bulletin，2010，11(2):171-176.

［24］NEI M.Analysis of gene diversity in subdivided populations［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1973，70(12):3321-3323.

［25］NEI M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals［J］.Genetics，1978，89(3):583-590.

［26］WORKMAN P L，NISWANDER J D.Population studies on southwestern indian tribes.II.Local genetic differentiation in the Papago［J］.Amer J Hum Genet，1970，22(1):24-49.

［27］WRIGHT S.The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating［J］.Evolution，1965，19(3):395-420.

［28］YEH F C，YANG R，BOYLE T J，et al.PopGene32.microsoft windows-based freeware for population genetic analysis，version 1.32［CP/CD］.2000.Molecular Biology and Biotechnology Centre，University of Alberta，Edmonton.

［29］GOMEZ A L，CARBONE I，RISTAINO J B.An andean origin of Phytophthora infestans inferred from mitochondrial and nuclear gene genealogies［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(9):3306-3311.

［30］MONTARRY J，ANDRIVON D，GLAIS I，et al.Microsatellite markers reveal two admixed genetic groups and an ongoing displacement within the French population of the invasive plant pathogen Phytophthora infestans［J］.Mol Ecol，201019(9):1965-1977.