二甲基亞砜對離體豬皮膚組織的拉曼光譜的影響＊

鐘會清，劉智明，倪藝榕，熊紅蓮，郭周義

(華南師范大學生物光子學研究院，激光生命科學教育部重點實驗室和中醫藥與光子技術國家中醫藥管理局三級實驗室，廣東廣州 510631)

0 引言

拉曼光譜技術(Raman)是從物質的分子振動光譜來識別和區分不同的物質結構的一種技術，具有快速、簡單、無損、準確等優點，已成為研究物質分子結構的重要手段，被公認為是研究分子結構和功能的有效方法之一［1］。由于拉曼光譜對生物組織病理微小的分子和結構的變化有很好的敏感性，很高的空間分辨率，不會導致自發熒光和光漂白作用，對水不敏感，樣品易準備等特性，使得拉曼光譜技術能應用于檢測人體組織結構、生理或疾病狀況，從而在分子水平上預測、診斷人體的健康狀況(包括各種癌癥)已成為物理學家與醫學家夢寐以求的愿望［2-5］。國內外學者已廣泛開展了拉曼光譜在人體組織，包括各種組織癌變［6-9］、血液［10-12］、皮膚疾病［13-15］等的檢測與診斷。然而，由于各種生物組織具有高散射性，因此不利于對深層組織的成像，使得拉曼光譜技術只能用于淺表組織區域。

為了改善光在組織中的滲透深度，多重散射必須降低。在1997年俄羅斯Tuchin研究小組利用近紅外光譜儀檢測了光透明劑作用后眼球組織，發現光透明及對反射光強的減少起作用，進而推斷光透明劑具有控制組織光學參數的作用［16］。隨后很多光學儀器被用來檢測光透明物質對其光學特性的影響，例如:光學相干層析成像技術(Optical coherence tomography，OCT)［17，18］，二次諧波成像［19］，近紅外光譜技術［20］等。本論文采用光透明劑---二甲基亞砜對拉曼光譜光學特性的影響進行研究。

1 材料和方法

1.1 材料和樣品的制備

新鮮豬皮組織(未去脂肪)來自合格的宰豬場，實驗樣品經蒸餾水清洗和除毛處理后，密封(防止自然失水)后保存在4℃的環境下不超過12 h，并在實驗前將樣品置于常溫下30 min，然后進行實驗。為了防止皮膚組織樣品在實驗過程中自然失水導致皮膚形態和性質發生變化，實驗中皮膚組織保持表皮朝上置于培養皿中，并在培養皿中注入磷酸鹽(Phosphate buffer saline，PBS)緩沖液，使皮膚樣品下端浸入PBS緩沖液，同時表皮暴露在空氣中。共切15個面積為2.5 cm ×2.5 cm，平均厚度為(2.0 ±0.65)cm的組織，在處理前和處理后的10 min，20 min，30 min，60 min都利用顯微共聚焦拉曼光譜儀進行檢測。

pH7.4 的 PBS溶液的配制:將 1.0 g KCl，40 g NaCl，1.2 g KH2PO4，18.16 g NaHPO4.12H2O(以上四種試劑均由天津市福晨化學試劑廠生產)，溶于400mL雙蒸水中，并調至 pH7.4，最后定容至500mL，得到10×PBS母液。使用前稀釋10倍即得1×PBS溶液，置于室溫下保存備用。

二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，濃度為100%)是購于天津市大茂化學試劑廠生產。本實驗選用的5%DMSO是按照100%DMSO與蒸餾水按體積5∶95的比例配制的。

1.2 實驗儀器

本實驗選用Renishaw inVia Reflex型顯微共聚焦拉曼光譜儀(英國Renishaw公司)，20倍鏡頭，波長為785 nm的半導體激光器作為激發光源，其到達樣品上的功率約50 mW，積分時間10 s，采集次數2次，光譜波數范圍為385～1539 cm-1，采用背向接收的方式采集樣品的拉曼信號。

1.3 統計學處理方法

采用Origin數據分析處理軟件及inVia Reflex型顯微拉曼光譜儀自帶的分析處理軟件WIRE3.2對數據進行累加處理及譜峰分析。

2 實驗結果及討論

2.1 豬皮膚組織和DMSO的拉曼光譜

在圖1(A)中854 cm-1為脯氨酸吡硌環C-C鍵振動峰，937 cm-1拉曼峰歸屬于豬皮組織中分子的C-C建骨架的伸縮振動，1003 cm-1拉曼峰歸屬于豬皮組織中苯基苯丙氨酸等。圖1(B)為DMSO的拉曼光譜的譜圖，其主要特征峰有680 cm-1，為 C-S伸縮譜;1014 cm-1、1419 cm-1處分別為S-O伸縮譜和CH3的振動譜，因為這兩個信號易受豬皮峰影響，而680 cm-1信號很強，因此之后我們對680 cm-1來觀察其在皮膚組織的滲透情況，以及對皮膚組織937 cm-1和1003 cm-1來觀察DMSO對皮膚組織的光透明性質的變化。

Fig.1 (A)Raman spectrum of porcine skin;(B)DMSO between 395 and 1539 cm-1.The dashed lines indicate the spectral signatures for the porcine skin and the spectral signature for DMSO.680 cm-1is the most different spectral signature comparing DMSO with porcine skin圖1 (A)和(B)分別為豬皮組織和DMSO在385～1539 cm-1區域的譜圖，其中虛線標注了皮膚的特征峰和DMSO，其中在(B)680 cm-1是DMSO與豬皮組織區別最大的特征峰

Fig.2 Raman spectra of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm after topically application of 5%DMSO at different time intervals圖2 離體豬皮膚組織經5%DMSO處理前、后在不同時間(0 min，10 min，20 min，30 min，60 min)及不同深度(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 的拉曼光譜的變化

2.2 DMSO作用于離體豬皮膚組織前后的不同深度的拉曼光譜的變化

為了研究DMSO對豬皮組織拉曼光譜的影響及其隨時間的變化，我們對經5%DMSO處理前(0 min)和后10 min，20 min，30 min，及60 min的豬皮不同深度(100μm，200μm，300μm，400μm)的拉曼光譜進行比較(如圖2)。從圖中發現，總趨勢是:皮膚組織的拉曼光譜強度隨著檢測深度的增加而逐漸降低，信噪比也逐漸降低。在表面下400μm處0 min時，其拉曼信號強度非常小，圖像信噪比也很低，937 cm-1和1003 cm-1處的峰幾乎被熒光背景所覆蓋。在經5%DMSO溶液處理之后，拉曼峰937 cm-1和1003 cm-1，的強度比處理前有了很大程度的改善，圖像信噪比也明顯提高了。此外，在沒有施加5%DMSO前在拉曼譜圖上消失拉曼峰1126 cm-1和1426 cm-1在施加5%DMSO后又重新出現。同時圖2(a-d)顯示，各層隨著處理時間的加長，5%DMSO對豬皮組織的拉曼光譜的效果也不斷的改善，其中在處理后60 min時，是各層拉曼信號最強。

2.3 DMSO作用于離體豬皮膚組織前后在不同深度其幾個峰強的變化

為了更好的分析5%DMSO對豬皮組織的拉曼光譜的影響，我們對圖2進行了進一步的量化比較，統計了皮膚組織在施加5%DMSO前、后(10 min，20 min，30 min，60 min)時距皮膚表面以下不同深度處各個主要特征拉曼峰(680 cm-1，937 cm-1和1003 cm-1)強度的變化。圖3顯示:各層在經5%DMSO處理后豬皮組織的各個峰及DMSO的特征峰的強度隨著時間的推移而不斷增強，并在60 min時強度達到最大。

Fig.3 The Raman peak intensities of porcine skin at(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm corresponding to the Raman spectra in Fig.2，The line styles represents a characteristic peak of the DMSO(680 cm-1)and porcine skin Raman spectra(937 cm-1and 1003 cm-1)，respectively圖3 分別表示DMSO(680 cm-1)和豬皮組織(938 cm-1，1003 cm-1)的特征峰在與圖2相對應的(a)100μm，(b)200μm，(c)300μm，and(d)400μm 不同層隨時間的變化情況

3 結論

通過對離體豬皮組織不同深度經5%DMSO處理前、后不同時間的拉曼光譜進行分析研究，以及對豬皮組織的拉曼光譜隨時間變化進行了實時監測，發現豬皮組織的拉曼光譜在處理后的60 min效果最好。結果表明:5%DMSO處理后的豬皮組織的拉曼光譜的信噪比有很大的提高，各特征峰的強度相對于處理前也有非常大的增強。這種增強效果幾乎是隨著施加5%DMSO的時間增加而加強。

［1］THOMAS G J.Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies［J］.Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，1999，28:1-27.

［2］HANLON E B，MANOHARAN R，KOO T W，et al.Prospects for in vivo Raman spectroscopy［J］.Physics in Medicine and Biology，2000，45(2):R1-R59.

［3］PETRY R，SCHMITT M，POPP J.Raman spectroscopy-A prospective tool in the life sciences［J］.Chemphyschem，2003，4(1):14-30.

［4］ELLIS D I，GOODACRE R.Metabolic fingerprinting in disease diagnosis:biomedical applications of infrared and Raman spectroscopy［J］.Analyst，2006，131(8):875-885.

［5］MOVASAGHI Z，REHMAN S，REHMAN I U.Raman spectroscopy of biological tissues［J］.Applied Spectroscopy Reviews，2007，42(5):493-541.

［6］HAKA A S，SHAFER-PELTIER K E，FITZMAURICE M，et al.Diagnosing breast cancer by using Raman spectroscopy［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(35):12371-12376.

［7］STONE N，KENDALL C，SHEPHERD N，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for the classification of epithelial pre-cancers and cancers［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2002，33(7):564-573.

［8］HUANG Z W，MCWILLIAMS A，LUI H，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for optical diagnosis of lung cancer［J］.International Journal of Cancer，2003，107(6):1047-1052.

［9］LIU R M，XIONG Y，TANG W Y，et al.Near-infrared surfaceenhanced Raman spectroscopy(NIR-SERS)studies on oxyheamoglobin(OxyHb)of liver cancer based on PVA-Ag nanofilm［J］.Journal of Raman Spectroscopy，2013，44(3):362-369.

［10］GNIADECKA M，WULF H C，NIELSEN O F，et al.Distinctive molecular abnormalities in benign and malignant skin lesions:studies by Raman spectroscopy［J］.Photochemistry and Photobiology，1997，66(4):418-423.

［11］INGLE T，DERVISHI E，BIRIS A R，et al.Raman spectroscopy analysis and mapping the biodistribution of inhaled carbon nanotubes in the lungs and blood of mice［J］.Journal of Applied Toxicology，2013，33(10):1044-1052.

［12］BOYD S，BERTINO M F，YE D X，et al.Highly sensitive detection of blood by surface enhanced Raman scattering［J］.Journal of Forensic Sciences，2013，58(3):753-756.

［13］STONE N，KENDALL C，SMITH J，et al.Raman spectroscopy for identification of epithelial cancers［J］.Faraday Discussions，2004，126:141-157.

［14］CASPERS P J，LUCASSEN G W，PUPPELS G J.Combined in vivo confocal Raman spectroscopy and confocal microscopy of human skin［J］.Biophysical Journal，2003，85(1):572-580.

［15］GONZALEZ F J，CASTILLO-MARTINEZ C，MARTINEZ-ESCANAME M，et al.Noninvasive estimation of chronological and photoinduced skin damage using Raman spectroscopy and principal component analysis［J］.Skin Research and Technology，2012，18(4):442-446.

［16］TUCHIN V V.Light scattering study of tissues［J］.Uspekhi Fizicheskikh Nauk，1997，167(5):517-539.

［17］TUCHIN V V，XU X Q，WANG R K.Dynamic optical coherence tomography in studies of optical clearing，sedimentation，and aggregation of immersed blood［J］.Applied Optics，2002，41(1):258-271.

［18］HE Y H，WANG RKK.Dynamic optical clearing effect of tissue impregnated with hyperosmotic agents and studied with optical coherence tomography［J］.Journal of Biomedical Optics，2004，9(1):200-206.

［19］LACOMB R，NADIARNYKH O，CAREY S，et al.Quantitative second harmonic generation imaging and modeling of the optical clearing mechanism in striated muscle and tendon［J］.Journal of Biomedical Optics，2008，13(2):021109.

［20］MATSUI A，LOMNES S J，FRANGIONI J V.Optical clearing of the skin for near-infrared fluorescence image-guided surgery［J］.Journal of Biomedical Optics，2009，14(2):024019.