不同人胚胎干細胞系向限定性內胚層分化能力存在差異＊

李 進，賀菁菁，林 戈，盧光琇*

(1.中南大學生殖與干細胞研究所，湖南長沙 410078;2.人類國家干細胞工程研究中心，湖南長沙 410078)

人胚胎干細胞(Human embryonic stem cells，HESCs)是來源于囊胚內細胞團的一群多能性細胞，由于其具有向三個胚層的所有細胞分化的能力以及在體外無限擴增的特點，自從1998年首次成功分離后，就一直作為再生醫學的重要種子細胞被廣泛的研究。然而，越來越多的證據顯示不同的HESCs之間存在分化能力的差異［1，2］。2008 年 Osafune K［3］研究發現不同的HESCs具有不同的胚層分化能力，有些細胞系很難分化得到內胚層和中胚層細胞。上述結果提示對單個HESCs而言，是否存在分化能力的傾向性而不能用于治療多種疾病。不同的細胞系之間是否真正的存在分化能力上的差異需要去驗證。

由于在HESCs培養和誘導分化過程中都是使用同一的處理條件，這種差異很有可能在HESCs階段就已經決定了。盡管HESCs表達絕大多數的共性表達的基因，但是每個細胞系也有自己唯一的基因表達特點［4］。C.Allegrucci等［5］研究結果顯示不同的人胚胎干細胞系之間在基因轉錄組和表觀遺傳學上存在差異。運用染色質免疫共沉淀聯合測序技術(ChIP-Seq)對轉錄因子檢測可以預知不同細胞系之間的差異基因表達［6］。這些在HESCs階段的差異是否與隨后的向特定譜系的分化能力的差異相關聯值得進一步的探討。

本實驗利用已經建立的HESCs細胞庫［7］資源和人胚胎干細胞向限定性內胚層分化平臺［8］，系統比較10株HESCs在誘導分化效率上是否存在差異，并嘗試尋找差異存在的原因。

1 材料與方法

1.1 胚胎干細胞來源與培養.

隨機選取人類干細胞國家工程中心提供的10株人胚胎干細胞系，在CF-1飼養層上培養擴增培養。每隔6-7天傳代一次，DF-ES培養基配方為，基礎培養基 DMEM/F12，15%SR，0.1 mmol/L β-ME，2 mmol/L L-Glu，4 ng/mL bFGF，1% 非必需氨基酸。

1.2 擬胚體(EB)分化實驗

HESCs在飼養層細胞上生長5-7天后，使用機械切割的方式，將HESCs克隆切割成大小相對均一的方塊，用200μLTip頭將方塊吹起，并轉移到60 mm的細菌培養皿中懸浮培養形成擬胚體，使用的DFEB培養基和DF-ES培養基相比，缺少bFGF因子，其余成分和比例一樣。

1.3 ActivinA和 Wnt3a共同作用誘導限定性內胚層

在Matrigel鋪皿的無飼養層體系上培養hESCs，培養至融合度大于80%時，去除分化細胞，用DPBS洗2～3遍，開始誘導實驗，誘導過程中基礎培養基為RPMI1640。誘導第1天，聯合Activin A(100 ng/mL)和Wnt3a(25 ng/mL)共同作用1天。第2天，使用Activin A(100 ng/mL)和 FBS(0.2%)作用一天。第3天，使用ActivinA(100 ng/mL)和FBS(2%)作用一天。經歷3天的誘導獲得Sox17陽性的限定性內胚層細胞。

1.4 免疫熒光染色

收集HESCs和分化后的限定性內胚層細胞用PBS洗去細胞中的培養基，添加4%的多聚甲醛溶液室溫下固定細胞30min，PBS清洗3遍，加封閉液(PBS中添加10%驢血清、0.1%的 triton-X-100和1%BSA)處理30 min，PBS清洗3遍，加入Oct4(小鼠抗人 Oct4單克隆抗體，1∶40稀釋，Santa Cruz)，Sox17(山養抗人Sox17，1∶50稀釋，R＆D)4度孵育一抗過夜。次日，PBS清洗3遍，加熒光二抗(驢抗羊Alexis 594，1∶1000;驢抗小鼠 Alexis 488，1∶1000)室溫避光孵育1 h，PBS清洗3遍，添加DAPI(1∶1000稀釋)染核，室溫避光孵育5 min，用 PBS清洗2遍，Nikon熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5 流式細胞儀計數SSEA-4和Sox17陽性比率

收集HESCs和分化后的限定性內胚層細胞用PBS洗去細胞中的培養基，每孔加入1mL accutase消化3min使HESCs成單細胞懸液，使用FBS buffer(DPBS+3%FBS)重懸并計數每孔細胞數目。細胞在Cytofix/cytoperm buffer(BD)固定過夜。選取1×105細胞每樣本開始實驗，添加 SSEA4-PE(BD)到HESCs中，添加Sox17-APC(BD)到分化后的限定性內胚層細胞中，4度孵育30 min到1 h，接著用FBS buffer洗3遍并重懸到400μL每樣本上樣檢測。

1.6 基因表達譜分析

選取 chHES8，chHES90，chHES45，chHES26四株sox17陽性率差異較大的細胞系抽提RNA，送樣檢測這些細胞系的基因表達譜。芯片版本為Human Genome U133 Plus 2.0 Gene Chip arrays，由北京博奧提供技術服務。應用GCOS軟件進行數據讀取，聚類分析由cluster 3.0軟件操作經Java TreeView讀取聚類圖，差異基因由SAM(Significance Analysis of Microarrays)軟件分析獲得。對篩選基因進行的熱圖通過MultiExpiments Viewer(Mev)軟件分析獲得。

1.7 realtime PCR

收集細胞并用 TRIZOL抽提 RNA。取1μg總RNA參照Promega公司試劑說明書進行逆轉錄操作，所得cDNA放置-20℃保存或繼續行PCR擴增目的基因。Realtime PCR檢測差異細胞系中MEG3和SNORD114-3的表達，同時擴增28 S作為內參。反應體系如下:PCR SYBRGREEN，10μL;引物，2μL;cDNA 模板，8μL;總體積，20μL。

2 結果

2.1 不同細胞系在EB分化中存在差異

為了驗證不同細胞系在分化能力上出否存在差異，隨機選取6株HESCs進行EB分化實驗，分別在d1，d3，d5和d7天觀察這些細胞的分化形態，結果不同細胞系呈現兩種不同的發展趨勢，一類細胞系像chHES90和chHES8隨著分化的時間推移，EB團塊能迅速增殖而且維持緊密狀態。而另一類細胞系像chHES26和chHES45隨著分化的時間推移，EB團塊越來越少，在day7只能檢測到極少數的團塊(圖1)。簡單的EB分化實驗說明，不同的細胞系在多能性維持和分化能力上確實存在差異。

圖1 不同HESCs間EB分化7天形態變化圖Fig.1 The morphologic change gram of 7 days EB differentiation between HESCs

2.2 不同細胞系向限定性內胚層分化過程中存在差異

上述結果中說明不同的HESCs存在的分化能力上的差異，為了進一步了解這些細胞系向特定譜系分化能力的差別，通過定向誘導分化為Sox17陽性的限定性內胚層細胞(圖2)，比較Sox17陽性細胞比率的差異。發現盡管在起始階段細胞都維持著相對的均一性(SSEA4均維持在90%以上的陽性細胞)，經過3天的誘導分化后，Sox17的陽性比率在這些細胞系中在60%～80%范圍內波動，結果說明不同的細胞系存在著向限定性內胚層誘導分化能力的差異(圖3)。

圖2 誘導不同階段的免疫染色結果Fig.2 The immunostaining results on different stage

圖3 不同細胞系間SSEA4和Sox17流式檢測結果Fig.3 The FACS result of SSEA4 and Sox17 between HESCs

2.3 不同細胞系基因表達譜分析結果

在向限定性內胚層誘導分化過程中，像Sox17和cxcr4等基因相對于HESCs有上調超過10倍以上的差異［9］。為了找尋這些細胞系存在差異的原因，選取了Sox17表達差異的明顯的細胞系檢測基因表達譜。重點關注這些在限定性內胚層中高表達的基因在不同的HESCs之間的表達情況，發現這些基因在差異細胞系中沒有明顯差異，表達值的差異倍數小于2倍(圖4)。有可能這些基因在HESCs起始狀態下還是處于一個預備啟動的狀態，并沒有完全活化。進一步尋找差異基因，發現像MEG3和SNORD114-3在差異細胞系之間和同株細胞早晚期代數之間存在表達差異(圖5)。realtime PCR驗證結果中除了chHESC8以外，其余的三株細胞系中這兩個基因在早期代數比初期代數下降非常顯著(圖6)。

圖4 內胚層高表達基因在不同HESCs之間的表達情況Fig.4 The expression of genes higher expressed in definite endoderm between HESCs

圖5 MEG3和SNORD114-3在不同細胞系中的表達情況Fig.5 The expression of MEG3 and SNORD114-3 between HESCs

3 討論

不同的HESCs確實存在著向限定性內胚層細胞誘導分化能力的差異，胚胎干細胞和誘導性多能干細胞的對比分析發現，Sox17和Foxa2的表達水平在誘導性多能性干細胞來源的限定性內胚層中要高于胚胎干細胞來源的限定性內胚層細胞［10］。嘗試尋找這些分化差異存在的原因，不僅能回答HESCs是否具有真正意義上的全能性，更能為誘導分化提供更多的改進和優化的信息。

圖6 Realtime PCR檢測MEG3和SNORD114-3在不同細胞系中的差異表達Fig.6 The difference expression of MEG3 and SNORD114-3 between HESCs by realtime PCR

關于干細胞基因表達譜的研究發現［11-13］，胚胎干細胞相比體內其它干細胞或終末分化細胞表達更多的基因，許多在分化細胞中表達的基因在胚胎干細胞都有微弱的表達。通過對比7株HESCs的表達譜發現，盡管整體上這些細胞系的基因表達是相似的，但是每個系具有自己差異表達的基因，而這些反應了自己的遺傳差異性并和可能的分化潛能相聯系［14］。Lars Palmqvist研究也提示比較不同細胞系的基因表達譜的差異與其多能性的評估之間存在相互關聯［15］。這四個細胞系的基因表達譜的對比分析結果中，在限定性內胚層細胞中高表達的基因在起始階段沒有超過2倍以上的表達差異，提示可能還有其他層面和途徑來調控這些差異的存在。

除了內在的特性影響到HESCs分化能力的差異，還有外在的干預因素也會影響到分化的差異［16］。MEG3和SNORD114-3屬于非編碼的小RNA參與基因的表達調控，并能參與到誘導性多能性干細胞的全能性調控［17］。結果中顯示 MEG3和 SNORD114-3在差異細胞系之間和同株細胞早晚期代數之間存在表達差異，這些差異與干細胞的分離時間段和培養過程所造成的表觀遺傳學修飾差異相關，可能是造成內胚層分化能力差異的原因。關于HESCs的表觀遺傳學調控發現［18-20］，關鍵的發育相關基因大多數都受高度保守的序列所調控，在HESCs中存在著“bivalent domains”保證這些基因處于表達的“引導狀態”，有利于接受外界的信號馬上啟動表達。關于這些非編碼小RNA調控差異的機制還需要更進一步的探索研究。同時，有研究比較了5株細胞系向造血分化潛能［21］，提示可以考慮比較這些細胞系限定性內胚層細胞接著向胰腺或者肝臟的分化差異，試圖找到更多的調控差異的因素。此外，通過這樣的比較，篩選出向內胚層分化能力有優勢的人胚胎干細胞系，可以作為向胰島素分泌細胞誘導分化的種子細胞。

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