辛伐他汀預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響及意義

張立濤 于織波 趙鶴齡

膿毒癥是由于感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，并常導(dǎo)致組織損傷和器官功能異常，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征。膿毒癥時(shí)往往合并心肌細(xì)胞損傷，心臟功能障礙，且發(fā)生率很高，機(jī)制復(fù)雜，其中細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。已有資料表明ICAM-1是心肌炎性反應(yīng)時(shí)中性粒細(xì)胞游走、聚集、發(fā)揮細(xì)胞毒作用必不可缺的跨膜蛋白質(zhì)，與心肌損傷明顯相關(guān)。他汀類藥物即3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是一種廣泛應(yīng)用的降脂藥物，并可以減少患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，他汀類藥物尚有與降低血脂無(wú)關(guān)的多種生物作用，這種多效性包括:抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝血、穩(wěn)定血管內(nèi)皮等，因此理論上他汀類藥物可以改善膿毒癥患者的預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)免疫組化的方法，觀察膿毒癥模型大鼠心肌細(xì)胞ICAM-1 的表達(dá)，并評(píng)價(jià)辛伐他汀預(yù)處理對(duì)其表達(dá)的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及處理清潔級(jí)健康雌性Wistar 大鼠60 只，體重200 ～250 g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào):909043)。飼養(yǎng)于恒溫(20℃)清潔飼養(yǎng)室，喂養(yǎng)普通大顆粒飼料，給予充足水分，通風(fēng)良好，溫度適宜。經(jīng)1 周適應(yīng)期后利用隨機(jī)數(shù)字表完全隨機(jī)化分組為正常組、膿毒癥組和辛伐他汀組，每組20 例。辛伐他汀組開(kāi)始喂養(yǎng)辛伐他汀20 mg/kg(舒降之，默沙東)，用0.9%氯化鈉溶液配成等濃度藥液灌胃(5 mg/ml)，1 次/d，持續(xù)2 周。正常組和膿毒癥組用0.9%氯化鈉溶液灌胃(4 ml/kg)，1 次/d，持續(xù)2 周。2 周后膿毒癥組和辛伐他汀組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，各組于術(shù)后48 h 分別取大鼠左心室心肌組織，置入10%中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 動(dòng)物模型制備采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)［1］建立膿毒癥模型。麻醉前禁食8 h，以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。常規(guī)消毒腹部皮膚，于腹部皮膚正中做切口，長(zhǎng)約2 cm，打開(kāi)腹腔后小心分離盲腸，避免損傷腸系膜血管。盲腸如有糞便，則輕輕將其擠向與其相連的大腸，在盲腸與小腸及大腸交界處，用4-0 絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸，避免結(jié)扎回腸和盲腸系膜血管。結(jié)扎完畢后仔細(xì)檢查，保持腸道通路暢通。在與腸系膜相對(duì)的盲端腸壁漿膜面用18 號(hào)針頭穿刺3 次，擠出適量腸內(nèi)容物，并留置一寬約0.2 cm，長(zhǎng)約3 cm橡皮引流條貫通盲腸，以防針孔閉合，輕輕將腸管放回原處，逐層縫合，關(guān)閉腹腔。

1.3 方法

1.3.1 石蠟切片行S-P 三步法免疫組織化學(xué)法染色:ICAM-1一抗為兔抗大鼠IgG 多克隆抗體(購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)，抗體稀釋比例為1∶200。

1.3.2 染色結(jié)果判定:ICAM-1 陽(yáng)性染色為在細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒沉著。陽(yáng)性細(xì)胞必須具備:①細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰;②陽(yáng)性顆粒定位、定性好;③著色明顯高于背景。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):參照Soslow［2］的評(píng)分方法，應(yīng)用美國(guó)多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)分析:每張切片隨機(jī)取5 個(gè)(×200)高倍視野，采用陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比雙重判定進(jìn)行評(píng)分，并將二者評(píng)分乘積作為最終評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):①顯色強(qiáng)度判定:陰性為0 分，弱陽(yáng)性為1 分，陽(yáng)性為2 分，強(qiáng)陽(yáng)性為3分;②陽(yáng)性細(xì)胞百分比判定:著色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)＜1%為0分，1%～10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～80%為3 分，81%～100%為4 分;③以陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分之積作為最終結(jié)果進(jìn)行判定，0 分為陰性，1 ～4 為弱陽(yáng)性(+)，5 ～8 分為陽(yáng)性(++)，9 ～12 為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，等級(jí)資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)及成對(duì)比較，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般情況膿毒癥組大鼠術(shù)后表現(xiàn)出無(wú)活力、反應(yīng)差、發(fā)紺、立毛和呼吸急促的特點(diǎn)。打開(kāi)腹腔后可見(jiàn)血性腹水，可聞及惡臭味，并發(fā)現(xiàn)部分大鼠腸管水腫，盲腸發(fā)黑，可見(jiàn)膿苔。相比之下，辛伐他汀組大鼠表現(xiàn)相對(duì)較輕。

2.2 ICAM-1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(1)正常組大鼠心肌細(xì)胞ICAM-1 蛋白表達(dá)微量。(2)膿毒癥組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多棕黃色或棕色顆粒沉著，與正常組比較明顯增加(P＜0.05)。(3)辛伐他汀組大鼠心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒與膿毒癥組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖1 ～3，表1。

圖1 正常組心肌細(xì)胞ICAM-1 的蛋白表達(dá)(SP×400)

圖2 膿毒癥組心肌細(xì)胞ICAM-1 的蛋白表達(dá)(SP×400)

圖3 辛伐他汀組心肌細(xì)胞ICAM-1 的蛋白表達(dá)(SP×400)

表1 3 組大鼠心肌細(xì)胞ICAM-1 蛋白表達(dá)情況比較n=20，例(%)

3 討論

本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，通過(guò)盲腸的結(jié)扎和穿孔，使有菌的腸內(nèi)容物污染腹腔造成彌漫性腹膜炎，誘發(fā)廣泛的全身性炎性反應(yīng)。結(jié)果表明:術(shù)后大鼠出現(xiàn)精神倦怠、躁動(dòng)、寒戰(zhàn)、發(fā)紺、腹脹和呼吸急促的特點(diǎn)。打開(kāi)腹腔后可見(jiàn)血性腹水，可聞及惡臭味，并發(fā)現(xiàn)部分腸管水腫，盲腸發(fā)黑，可見(jiàn)膿苔。以上均提示膿毒癥模型制備成功。

ICAM-1 是免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面跨膜蛋白質(zhì)，是由細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的一類膜表面糖蛋白分子，廣泛表達(dá)于各種組織細(xì)胞表面。其與配體淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)相結(jié)合，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與活化、細(xì)胞的伸展和移動(dòng)、生長(zhǎng)及分化、炎性反應(yīng)、血栓形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及創(chuàng)傷愈合等一系列重要的生理病理過(guò)程。正常情況下，心肌細(xì)胞表面ICAM-1 表達(dá)量極低，但在膿毒癥時(shí)，細(xì)胞因子如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等和脂多糖(LPS)可使心肌細(xì)胞ICAM-l 表達(dá)增加，而ICAM-l 在介導(dǎo)白細(xì)胞由血管內(nèi)向血管外游走，并造成心肌損傷的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。van Griensven 等［3］證實(shí)ICAM-l 基因已被敲除的小鼠在膿毒癥模型中的炎性反應(yīng)明顯減弱，肺臟、肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，組織損傷相對(duì)較輕，死亡率明顯低于對(duì)照組。Davani 等［4］發(fā)現(xiàn):LPS 可使心肌組織ICAM-1 表達(dá)明顯增加，并使左心室心肌收縮力明顯減弱，作者認(rèn)為這與ICAM-l 所致心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系密切。本研究同樣發(fā)現(xiàn)膿毒癥模型組大鼠心肌細(xì)胞ICAM-1 蛋白表達(dá)明顯增加，證明其與心肌炎性反應(yīng)，中性粒細(xì)胞侵潤(rùn)，心臟功能障礙明顯相關(guān)。

他汀類藥物抗膿毒癥作用機(jī)制較為復(fù)雜，同時(shí)也是多方面的。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明膿毒癥時(shí)他汀類藥物可以在不同水平、不同機(jī)制上發(fā)揮臟器保護(hù)作用，抑制炎性反應(yīng)［5］，改善功能障礙，降低膿毒癥模型的死亡率［6］。本實(shí)驗(yàn)主要探討辛伐他汀對(duì)膿毒癥模型心肌細(xì)胞ICAM-1 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示:造模后48 h 經(jīng)辛伐他汀預(yù)處理的膿毒癥大鼠心肌細(xì)胞ICAM-1 的蛋白表達(dá)較膿毒癥組明顯減少(P ＜0.05)，因此理論上可以減少膿毒癥時(shí)心肌組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制炎性反應(yīng)，改善心臟功能。關(guān)于辛伐他汀可以減少ICAM-l 表達(dá)的機(jī)制可能與其抑制心肌細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等上游信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)［7］，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)免疫組化的方法研究辛伐他汀預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠心肌組織ICAM-1 表達(dá)影響，受研究方法與樣本數(shù)所限，結(jié)果存在一定局限性。并且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然證實(shí)辛伐他汀預(yù)處理可以抑制ICAM-1 的蛋白表達(dá)，但是辛伐他汀組同正常組相比仍有明顯差異，因此20 mg/kg 的辛伐他汀預(yù)處理劑量只是參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行的探索性實(shí)驗(yàn)，其他劑量與種類的他汀類藥物的實(shí)驗(yàn)效果有待進(jìn)一步研究。

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