不同頻率給予地塞米松對大鼠脛骨皮質骨和松質骨的影響

楊國柱，李青南，陳嘉儀，林曉靜，陳 珺，盧 麗，

賈歡歡2，黃 韌2，陸幸妍1

（1.廣東藥學院新藥功能研究中心 廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.廣東省實驗動物監測所 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東 廣州 510633）

臨床上有許多患者需要短期、長期甚至終生使用糖皮質激素（gl ucocorticoid，GC），然而GC治療往往會導致骨量丟失，繼而引起骨質疏松［1］，骨量丟失程度隨著GC治療劑量和時間的變化而變化，其機制很復雜，至今尚不清楚。探討GC性骨質疏松（gl ucocorticoid－induced osteopor osis， GIOP）疾病的發生機制的動物模型多為大鼠［2］，但由于制備方法很不規范［2－4］，如所采取的造模方法、動物類型及觀察時間和部位各異，給研究造成許多不便。

目前普遍認為GC引起骨量丟失的程度與其累積劑量和應用時間等有關［5－6］。本小組曾對雌性大鼠間斷性肌注地塞米松（dexamet hasone，Dex），每次2.5 mg·kg－1［7－8］，每周2次，發現42和90 d時，Dex可造成皮質骨骨量的丟失，但對松質骨沒有影響。因此，本研究調整Dex劑量為1 mg·kg－1、頻率分別為每周2次、4次和6次，持續30 d，采用骨形態計量學方法［7］觀察3月齡SD大鼠脛骨皮質骨和松質骨的改變，以期為GIOP模型標準化及為其預防和未來臨床干預提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及主要儀器

Dex磷酸鈉注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，規格1 ml∶2 mg；批號110303）。戊巴比妥鈉AR（中國醫藥集團上海化學試劑），EDTA（Bioshar p公司產品），多聚甲醛（天津市福盆化學試劑廠），乙醇（天津市百世化工有限公司）。Leica EG1160型包埋機，Leica RM2500型切片機（德國Lecia公司），Oly mpic IX51生物顯微鏡，骨形態計量學測量系統（美國Osteo Metrics公司）。

1.2 動物與分組

3月齡SPF級雌性SD大鼠32只，體質量（200±20）g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供〔質量合格證編號：SCXK（粵）20100020〕。分籠飼養于室溫24～28℃，相對濕度50%～70%的清潔環境中，隔日更換墊料，自由攝食和攝水。適應性喂養1周后，隨機分為4組，每組8只：正常對照組僅肌內注射生理鹽水，Dex組肌內注射 Dex 1.0 mg·kg－1，按照給藥次數，分為2次，4次和6次；每周稱體質量1次，并按體質量調整給藥劑量，共計給藥30 d。

1.3 骨組織切片制作

給藥30 d后戊巴比妥鈉麻醉大鼠，心臟抽血處死，取右側脛骨鋸出上段（pr oxi mal tibia metaphyses，PTM）和中段（middle part of tibia shaft，TX），經10%EDTA脫鈣處理后行石蠟包埋，切4μm薄片，HE染色。

1.4 骨組織形態計量學檢測

本實驗采用BIOQUANT OSTEO骨組織形態圖像分析系統（BIOQUANT Image Anal ysis Corporation）用以測量骨形態計量學參數［7］。骨組織形態計量學參數分為靜態參數和動態參數，通過靜態參數可以分析骨量和骨的結構，動態參數為反映骨形成和骨吸收的指標。

松質骨靜態參數包括反映骨量的骨小梁面積百分數（trabecular area，%Tb.Ar）、反映骨小梁形態結構的骨小梁寬度（trabecular width，Tb.Wi，μm）、骨小梁數量（trabecular nu mber，Tb.N）和骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp，μm）。皮質骨靜態參數包括反映骨外膜骨形成的骨組織總面積（total tissue area，T.Ar）、反映內外骨面變化的皮質骨總面積（cortical area，Ct.Ar）、反映骨內膜面骨吸收與骨形成情況的骨髓腔面積（marr ow area，Ma.Ar）、皮質骨厚度 （cortical bone thickness，Ct.Th）、骨外膜面周長（periosteal peri meter，P－Pm）和骨內膜面周長（endocortical peri meter，EPm）。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 不同頻率給予地塞米松對大鼠骨組織的影響

脛骨上段松質骨HE染色結果顯示，正常對照組骨小梁排列密集，小梁寬、間距小，骨小梁之間的連接較多（圖1 A1）；每周2次組與正常對照組相比無明顯變化（圖1 A2），4次組和6次組骨小梁寬度變窄，其他指標無明顯肉眼可見的變化（圖1 A3，圖1A4）。

脛骨中段皮質骨的HE染色結果顯示，正常對照組的皮質骨切片呈現淡紅色、中空環狀結構（圖1B1）；每周2次和4次組未見明顯差異（圖1B2，1B3）；6次組 Ct.Th和 Ct.Ar相對減少（圖1B4）。

Fig.1 Effect of dexamethasone（Dex）at different frequency on proxi mal tibia metaphyses（A）and middle part of tibia shafts（B）of rats（HE×2）.Dex 1 mg·kg－1 was given，i m，for t wice，four and six ti mes a week，respectively，and lasting 30 d.1：nor mal contr ol gr oup；2：t wice a week gr oup；3：f our ti mes a week group；4：six ti mes a week group.Arrows show the trabeculae.

2.2 不同頻率給予地塞米松對大鼠脛骨上段松質骨形態計量參數的影響

如表1所示，每周2次 Dex，%Tb.Ar和Tb.Wi有所下降，但與正常對照相比差異無統計學意義；而4次和6次組脛骨上段，%Tb.Ar和Tb.Wi明顯減少（P＜0.05），說明Dex給藥30 d后，4次和6次組大鼠松骨量出現了骨量和骨結構的破壞，而2次組沒有改變。上述3組給予Dex 1 mg·kg－1，對Tb.N和Tb.Sp無顯著影響，說明短時間30 d Dex主要表現為影響松質骨骨小梁的寬度。

Tab.1 Effect of Dex 1 mg·kg－1 on histomor phometric parameters of the pr oxi mal tibia metaphyses of rats

2.3 不同頻率給予地塞米松對大鼠脛骨中段皮質骨形態計量參數的影響

如表2所示，與正常對照組相比，每周2次、4次和6次組T.Ar和P－Pm均顯著降低（P＜0.05），但對Ma.Ar和E－Pm無影響。6次組還可顯著降低Ct.Th和%Ct.Ar（P＜0.05），而其他兩組對此無影響。說明短時間內皮質骨對GC較為敏感，2次組已出現骨量的減少。而4次組Ct.Th與正常對照組比較無顯著差異，而2次和6次組的Ct.Th均減少，這可能與Dex的用藥頻率有關。

3 討論

本實驗結果顯示，30 d不同頻率GC給藥后，每周2次組大鼠松質骨各項指標無明顯變化；4次和6次組大鼠的%Tb.Ar，Tb.Wi明顯減少，但Tb.N，Tb.Sp未見變化，說明4次和6次組大鼠松質骨的骨微細結構已經發生退化，骨量和骨結構均出現了改變。提示在模型制作過程中，可以考慮在保持原有劑量的基礎上，加大GC給藥的頻率，這樣可以縮短模型制作時間，節約制作成本，從而降低動物的損耗。鑒于大鼠骨骼的長度、質量和骨密度在1～3月齡呈急速生長，3個月后骨生長速率變得平緩，直到6月齡后骨骼可保持很長一段時間穩定［9］，推測每周2次組的松質骨造模結果不理想，可能是大鼠處于骨平緩的生長塑造期，為保持骨密度和生物學作用，骨量發生了從皮質骨向松質骨的轉移［8－9］，觀察時間短和用藥頻率較低進一步掩蓋了松質骨應有的改變。

不同頻率給予Dex對大鼠皮質骨作用也不盡相同。上述組T.Ar均明顯減少；尤以6次組表現明顯，T.Ar，Ct.Th，Ct.Ar均明顯減少。在每周2次組皮質骨已經出現骨量減少，隨頻率的增加骨丟失越發明顯，說明在調整頻率和劑量、時間后，短時間內即可觀察到GC對皮質骨的影響。目前研究一致認為，GC通過破骨細胞介導的骨吸收及抑制成骨細胞介導的骨形成引起骨質疏松，其中GC對皮質骨的影響主要是使骨內外膜的骨形成減少，同時骨內膜面的骨吸收增加，從而出現皮質骨變薄，骨髓腔增大的情況［10］。本實驗給Dex 3個頻率組骨外膜周長均減少，骨內膜周長與正常對照組無差異，骨外膜周長與內膜周長變化不一致，可能是由于成骨細胞在骨外膜面分布比骨內膜面的多，成骨細胞作為最主要的骨形成細胞，也是GC作用于骨骼的主要靶點，對GC有著高敏感性；GC不僅降低成骨細胞的分化和成骨能力，而且還促進了成骨細胞和骨細胞的凋亡［8，11－12］。因本實驗觀察時間較以往稍短，更加凸顯了成骨細胞較破骨細胞對Dex應激的敏感和迅速，骨外膜的骨形成明顯受抑制，尤其每周2次組表現更為明顯，這也與Tsa mpalier os等［13］和Yang等［14］的觀點一致，可能與GC作用后，導致皮質骨應激性地縮小，骨骼縱向生長變緩，從而維持骨密度不變或者增加，進而維持骨骼原有的生物力學功能有關。

Tab.2 Effect of Dex 1 mg·kg－1 on histomor phometric parameters of middle part of tibia shaft cortical bone of rats

值得注意的是，每周4次組Ct.Th與正常對照組比較沒差異，而2次和6次組Ct.Th均減少，這可能與Dex的用藥頻率有關［6］。一方面，4次組可能降低了大鼠成骨細胞對Dex的敏感性，從而減弱了Dex引起的骨量丟失，皮質骨的骨形成和骨吸收達到一個穩態，皮質骨厚度得以維持。另一方面，也可能與GC對成骨的雙向作用有關［14］。2次組皮質骨的骨形成減慢，得以維持松質骨骨結構和骨量沒有損失，而6次組，則皮質骨和松質骨的骨形成均減緩，即使GC引起骨從皮質骨到松質骨轉移，仍不足以維持松質骨的骨結構和骨量，同時皮質骨的骨量大大減少，GC對破骨細胞的作用得以凸顯。因此，2次和6次組分別凸顯了外膜骨形成的抑制和內膜骨吸收的促進兩個作用。

綜上所述，經調整Dex的劑量、頻率和時間后，30 d給藥即可觀察到大鼠脛骨的松質骨和皮質骨出現相應骨量減少的改變，隨著頻率的增加，不同頻率組的松質骨和皮質骨的表現各異。本研究也是首次報道頻率對GIOP建模的影響，以及皮質骨和松質骨同時對GC產生的不同應激反應，提示建立GIOP模型時，應充分考慮不同類型骨骼的變化情況，合理設計用藥劑量和頻率，也為臨床上GIOP的預防和干預、GC的用藥方式提供一定的實驗基礎。

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