基于網絡藥理學的個體化治療與藥物組合設計

熊江輝，聶舒媛，李瑩輝

(1.中國航天員科研訓練中心航天醫學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094;2.武漢大學藥學院，湖北武漢 430072;3.香港中文大學深圳研究院，廣東深圳 518057)

藥物發現的中心任務是確定人體基因/分子組成與疾病表型之間的依賴關系。而疾病的表型可由個體的基因決定，干擾這些基因的表達可能導致表型的改變，如從疾病到正常的轉變。復雜疾病一般依賴于多種基因而非單一基因的改變。因此，研究與同一表型相關的多個基因之間的相互作用十分重要。網絡藥理學通過解析分子網絡中多種組分之間的相互關系來研究疾病條件下的特征性網絡改變，并研究藥物作用下該網絡受到擾動的模式，從而實現網絡層面上的藥物作用機制研究[1]。

協同致死(synthetic lethality)是腫瘤藥物發現及網絡藥理學研究中的一個重要概念。協同致死是指兩個基因間一種特定的相互關系:兩基因中任一基因發生突變，細胞仍可存活，但若同時突變便會使細胞死亡[2]。利用協同致死原理有利于發現更為有效的癌癥治療方案。例如，ADP－核糖聚合酶〔poly(ADP－ribose)phosphatase，PARP〕與乳腺癌Ⅰ型敏感性蛋白(breast cancer typeⅠ susceptibility protein，BRCA)是某癌癥中協同致死的兩個基因，通過抑制PARP可開發出針對BRCA突變型腫瘤的靶向藥物[3]。一項最近的綜述表明，基于協同致死原理的處于臨床開發階段的藥物已超過21種，而基于PARP和BRCA協同致死原理進行的臨床試驗已超過63個[4]。通過基因測試檢測BRCA突變情況，據此選擇是否采用PARP抑制劑給藥治療是一種典型的個體化治療策略[5]。多項實驗證明，藥物組合聯用可明顯提高單一腫瘤藥物的敏感性[6－8]。將此方法擴展到全基因組網絡層面上，即通過篩選基因之間的協同致死關系，建立協同致死的基因網絡，識別多個節點的擾動，可能成為一種藥物組合理性設計的方法。

1 基于基因表達模式的藥物組合理性設計方法

Lamb等[9]設計的 CMAP項目(Connectivity Map)是最早利用基因表達譜來建立小分子、基因和疾病之間相互關系的成功案例。通過CMAP可指導設計藥物組合及個體化治療。以地塞米松為例，地塞米松為治療急性淋巴細胞白血病藥物，作者首先通過基因芯片實驗，得到地塞米松敏感細胞系和耐受性細胞系之間的差異基因表達譜，然后通過查詢各種小分子化合物處理時細胞基因表達譜的變化，成功地識別出可逆轉地塞米松耐藥性(提高地塞米松敏感性)的藥物西羅莫司。

該方法的基本過程(圖1)如下:

步驟1:首先選擇對某疾病有治療效果的藥物1，通過敏感細胞系和耐受細胞系的比較，或者藥敏患者與耐受患者的比較研究，得到藥物敏感性相關的基因表達譜。如圖1所示，圖中基因1為與藥物1敏感性呈正相關的基因(圖1A)，基因2為負相關基因(圖1B)。

步驟2:CMAP數據庫中包含有多種小分子化合物處理引起的細胞基因表達譜變化模式。因此，在數據庫中尋找篩選與藥物1敏感性正相關的藥物2。如圖1C所示，若藥物2能上調基因1，并同時下調基因2，則藥物2即為提高藥物1藥敏性的候選藥。

作者同時給出證據證實，藥物1和藥物2聯用比單獨藥物1處理條件下對腫瘤細胞的療效更顯著(圖1D)。

值得注意的是，該方法使用全基因組表達譜尋找最佳藥物組合，而不是顯示地使用基因網絡進行藥物組合理性設計，該種方法實際上是“基于基因表達標簽(signature)的方法”而非“基于網絡的方法”。

圖1 基于基因表達譜的藥物組合理性設計[10].A:基因1是與藥物1敏感性呈正相關的基因;B:基因2是與藥物1敏感性呈負相關的基因;C:以藥物1藥敏性為查詢條件，尋找能上調基因1同時下調基因2的藥物作為候選組合藥物;D:藥物1(地塞米松)與藥物2(西羅莫司)的組合確實可以提高藥物敏感性.

2 基于協同致死進行藥物組合理性設計

通過遺傳篩選(genetic screening)尋找與已知化合物有協同致死效應的基因，可以發現與已知藥物敏感性顯著相關的新基因，從而通過靶向這些新基因的藥物，可以發現有效的化合物組合，從而增強單個藥物的療效。Whitehurst等[8]將高通量和高內涵的細胞篩選平臺與全基因組RNA干抗(RNA interference，RNAi)文庫技術相結合，建立了一個與紫杉醇相關的協同致死基因篩選實驗體系，發現并鑒定了一系列紫杉醇處理條件下能選擇性降低細胞存活率的基因靶標。這些靶標基因的功能分類主要涉及蛋白酶體、微管相關和細胞黏附等生物學過程。值得注意的是，對某些新識別出來的靶標的干擾可以使肺癌細胞對紫杉醇的敏感性提高1000倍。由本例可以看出，協同致死策略能給藥物組合設計提供一個有效的途徑:將靶向紫杉醇協同致死基因的藥物與紫杉醇聯用，從而使腫瘤細胞致死(圖2)。據此可設計蛋白酶體抑制劑和紫杉醇的藥物組合。事實上，硼替佐米(蛋白酶體抑制劑)與紫杉醇聯用的藥物組合已應用于臨床研究中[11]。

圖2 基于協同致死的藥物組合設計原理[10].

協同致死也可用于通過藥物組合，提高靶向藥物的療效，抑制其耐藥性。Astsaturov等[12]通過集成多種數據集建立了以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為中心的信號網絡，進而通過RNAi文庫篩選，得到了對EGFR抑制劑具有增敏作用的基因集合。以該基因集合中的信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducerand activator of transcription 3，STAT3)基因為例，作者將針對STAT3的抑制劑stattic與厄洛替尼(一種針對EGFR的酪氨酸激酶抑制劑)組合，證實藥物組合可協同降低腫瘤細胞的存活率，抑制腫瘤生長。

3 基于協同致死概念設計個性化治療

Luo等[5]設計了基于協同致死篩選設計個體化癌癥治療的方法。通過全基因組RNAi篩選，作者鑒定了一系列與癌基因KRAS(一種常見的突變型人類癌癥基因)具有協同致死效應的基因。這些基因主要涉及與有絲分裂激酶PLK1(Polo－like kinase 1)和蛋白酶體相關的信號轉導通路。抑制這些通路可導致Ras突變型細胞死亡。從上述角度出發可設計個體化治療策略，以細胞分裂周期蛋白16(cell division cycle protein 16，CDC16)為例，其設計過程如下(圖3):

第一步:分析Ras正常型癌癥患者群體中CDC16基因的表達值與預后的相關性。如圖3A所示，CDC16高表達(紅線)與CDC16低表達(藍線)患者的生存曲線無明顯的差別，Log－rank分析的P值為0.67，表明在Ras正常型患者中，CDC16基因表達與患者的預后無關。因此，在這組患者中進行針對CDC16的靶向治療可能無效。

第二步:分析Ras突變型癌癥患者群體中CDC16基因表達值與預后的關系。如圖3B所示，CDC16高表達(紅線)與CDC16低表達(藍線)患者的生存曲線具有顯著差別，Log－rank分析的P值為0.02，表明在Ras突變型患者中，CDC16基因表達與預后顯著相關，推測對這組患者進行針對CDC16的靶向治療可能有效。

第三步:綜合以上分析結果，可設計如下個體化治療策略，在進行CDC16靶向治療前，對患者Ras基因突變情況進行檢測。如果結果為陽性即Ras突變型，可推薦CDC16靶向治療;若為陰性，則不考慮采用CDC16靶向治療。

圖3 基于協同致死設計個體化治療的原則[8]

類似地，Scholl等[13]使用高通量RNAi篩選確定了癌癥細胞中與KRAS協同致死的基因，并發現絲氨酸/蘇氨酸激酶33(serine/threonine kinase 33，STK33)可以作為KRAS突變型癌癥患者的治療靶標。然而，在癌癥細胞系或者初期癌癥患者樣本中STK33并沒有結構異常或表達異常，這說明STK33并不是一個傳統意義上的致癌基因。最近有研究表明，癌癥的發生不僅僅依賴于驅動癌變的傳統意義上的“癌基因”的突變，還取決于一些“正?！被?，該現象被稱為“非致癌基因成癮”(non－oncogene addiction)[14－15]。實際上，上述協同致死基因的篩選即為鑒定“非致癌基因成癮”現象提供了一種有效的方式。

4 協同決定預后(synergistic outcome determination，SOD)——一種與協同致死類似的遺傳相互作用

最近，本課題組提出了一種新的遺傳相互作用，稱為“SOD”。SOD與協同致死類似，是指由一對基因協同影響癌癥患者的預后表型，而單個基因的表達與患者預后無顯著的相關性[16]。如圖4所示，基因(基因A和基因B)的表達及與表型(預后)的關系如下:①基因A和基因B都有低表達和高表達兩種狀態;② 紅色三角形代表“預后差”的患者(生存時間較短或轉移)，綠色矩形代表“預后好”的患者(存活時間更長或非轉移);③單個基因的表達與患者的預后無關，基因A為低表達時，所有基因A低表達的患者都分布在兩個簇，50%分布在“預后差”(圖4中的“左下”象限)，50%分布在“預后好”(圖4中的“左上”象限);④ 集成兩個基因的表達信息可確定患者的預后情況，若基因A為低表達、同時基因B為高表達時(圖4中的“左上”象限)，所有的患者都為“預后好”。

圖4 協同決定預后(SOD)的概念[16].

在上述方法中，協同決定患者預后的基因－基因之間的配對可用一種基于信息學的算法來確定[16]。SOD與協同致死有幾個不同的特征(表1):①“協同致死”涉及的表型在細胞水平(如細胞死亡)，而SOD涉及的表型在生理層面(如患者的生存期等表型)。因此，SOD可以建立“基因層”事件和臨床表型之間的直接聯系。②由于倫理受限，無法在人體內通過實驗篩選協同致死的基因。目前，高通量協同致死篩選僅僅局限于體外培養人體細胞系[8]。而SOD可通過患者預后信息及其腫瘤組織的基因表達數據計算得出。③協同致死篩選使用的是體外細胞系的基因表達數據，而SOD使用的是源自體內的腫瘤組織的基因表達數據。理論上，SOD能夠捕捉“組織層面”的事件，而不僅是“細胞層次”事件。這對于腫瘤學研究十分重要，因為從腫瘤組織中得到的基因表達譜實際上包括上皮細胞及微環境中其他細胞混合物的表達信息。

表1 SOD與協同致死的概念比較

5 基于SOD進行藥物組合理性設計

基于SOD理論，可以建立與預后等臨床表型相關的基因－基因間協同作用網絡?；诖嘶颍蜷g相互依賴關系，可將藥物敏感性基因映射到SOD網絡中，從而建立一種藥物組合設計的方法，其原理與計算過程如下:

第一步:計算某癌癥特異SOD網絡中每個基因節點受到某特定藥物擾動的擾動值，從而將藥物對網絡的擾動信息通過藥物敏感性基因投射到基因網絡中[16]。如圖5A，主藥物有4個敏感性基因(基因1，2，3和4)，標記“1”，表示主藥物的作用模式。

第二步:計算某特定藥物對網絡中的“邊”的擾動情況。SOD網絡中的邊表示2個基因之間存在協同關系。只有當兩節點同時標記為“1”，此擾動邊才能被標記為“1”，反映藥物對2個基因的共同擾動。如圖5A中主藥物同時擾動基因1和基因4，因此，基因1和基因4之間的邊可標記為“1”。

第三步:通過以下公式計算藥物對全局網絡的擾動系數(perturbation index，PI):

其中，N為網絡中總的邊數;M為網絡中總的基因節點數;Di為基因節點i的擾動值;Dj為邊j的擾動值。舉例如下:① 如圖5A所示，主藥物擾動1個邊(基因1和基因4間的連接)和4個節點，因此，主藥物的PI為1/4=0.25;②考慮輔藥物1與主藥物的組合，其作用模式如圖5B所示。輔藥物1增加了一個對基因5的擾動，從而改變了基因5相關的三條邊(基因1和基因5之間的連接，基因2和基因5之間的連接，基因3和基因5之間的連接)，因此，該藥物組合的PI為4/5=0.8;③ 考慮另一候選輔藥物2，主藥物與輔藥物2組合的作用模式如圖5C所示，輔藥物2增加了對基因6的擾動，但是只改變了一條邊(基因3和基因6之間的連接)，該藥物組合的PI為2/5=0.4;④ 藥物組合(主藥物+輔藥物1)的PI高于組合(主藥物+輔藥物2)，因此，主藥物+輔藥物1的組合要優于主藥物+輔藥物2。

上述例子中，候選輔藥物1和輔藥物2都擾動了一個基因，但是結果卻顯著不同。原因在于，輔藥物1擾動的基因5與其他基因有較多的協同作用。

6 結論和展望

圖5 基于SOD進行藥物組合理性設計[10].

綜上所述，在用藥物對抗疾病的“戰役”中，以描述基因和疾病表型之間依賴關系的網絡可以成為藥物組合理性設計與個體化治療設計的“作戰地圖”。除了通過RNAi等功能篩選實驗得到的協同致死網絡，通過生物信息學方法計算得到的遺傳相互關系網絡亦可用于測試藥物組合的協同效果。在有關網絡藥理學的早期文獻中討論了許多基于蛋白質相互作用網絡的研究，而本文中討論的通過計算得到的遺傳相互作用網絡則極大地豐富了“網絡藥理學作戰地圖”的內涵，理論上，可以通過各種層面定義這種遺傳相互作用網絡。①一種表型確定一種遺傳相互作用。協同致死關系是通過體外實驗中細胞存活率來決定，該關系中涉及的細胞表型可以是模式生物(如酵母菌)或體外培養的人體細胞的生。長情況也可以通過藥物與基因之間的相互作用來定義新的遺傳相互作用。例如，某腫瘤藥的藥敏性依賴于某個基因，該基因可通過該藥物處理下的RNAi實驗而篩選獲得[8]。該種遺傳相互作用中涉及的表型是細胞在藥物和RNAi雙重干擾下的細胞存活率。②生物系統中不同系統層面事件可以定義不同的遺傳相互作用。由于復雜的生物系統可分成多種層面，因而不同層面上各事件(如基因水平、基因模塊水平和細胞水平等)之間的相互作用研究也很重要。例如，在基因模塊水平，可通過某協同算法推算出決定疾病表型的異?；蚰K之間的相互作用關系[8]，進而可應用于藥物組合設計[16]。在組織水平，不同細胞之間的依賴性與表型有關，以組織微環境內細胞間的相互關系(如癌癥細胞和基質細胞[16－17]，腫瘤干細胞及其生態位[18])為靶標的藥物組合將有可能逆轉體內癌癥藥物的耐藥性。

以蛋白質－蛋白質相互作用為代表的物理相互作用(physical interaction)本身不包含表型方面的信息，而遺傳相互作用(genetic interaction)是“基因－基因－表型”(或“基因－藥物－表型”)三元組之間的一個特定關系。在這種關系中，由于特定表型信息的引入，使得遺傳相互作用更適于藥理學研究。生物體不同系統層面中可以定義不同的表型，表型的多樣性給定義新型的遺傳相互作用提供了極大的創新空間?？梢灶A見，遺傳相互作用網絡將在基于網絡的藥理學研究中發揮更大、更廣泛的作用。

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