胰島素降低海馬谷氨酸和D-絲氨酸含量改善糖尿病大鼠空間學習記憶能力

楊 菁，楊 岳，宋 揚，楊清俊，李宗澤，張永興，王洪新

(1.遼寧醫學院遼寧省心腦血管藥物基礎研究重點實驗室，遼寧錦州 121001;2.中國醫科大學七年制96期，遼寧沈陽 110001;3.廈門大學醫學院，福建廈門 363000)

糖尿病是一種以血糖升高為特征的代謝紊亂綜合征，發病率逐年上升，我國每年約增加120萬糖尿病患者[1]，已經成為糖尿病第一大國。糖尿病導致的學習記憶損傷早在20世紀20年代就有報道[2]。在臨床表現中表現為認知功能障礙、癡呆和精神性疾患等慢性腦病癥狀，稱為糖尿病性腦病(diabetic encephalopathy，DE)[3－5]。已發現 DE與大腦微血管病變[6]、氧化應激[7]和非酶性蛋白糖基化[8]等有關，但其發病機制還不明確。

N-甲 基-D-門 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體在突觸可塑性及興奮毒性等方面均具有重要作用。NMDA受體NR1亞基上存在一個“甘氨酸位點”，該位點必須被結合后谷氨酸才能開放NMDA受體偶聯的離子通道。而研究表明，D-絲氨酸與甘氨酸結合位點的結合效能比甘氨酸的更高，是真正的NMDA受體的共激活因子[9－10]。NMDA受體的過度激活可導致學習記憶損傷。本研究采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptotocin，STZ)制備糖尿病模型，觀察胰島素治療對糖尿病大鼠空間學習記憶能力的影響，并測定海馬組織中谷氨酸及D-絲氨酸含量變化，探討胰島素的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和主要儀器

健康雄性SD大鼠，體質量190～210 g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-2010。谷氨酸對照品，上海康達氨基酸廠生產，純度為99.9%。D-絲氨酸(純度99.9%)、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)、N-異丁酰基-D-半胱氨酸(N-isobutyryl-D-cysteine，IBDC)和 STZ為 美 國Sigma公司產品。精蛋白鋅胰島素注射液(長效胰島素，10 ml∶400 U)，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公式生產。乙腈和甲醇為色譜純;其余試劑均為國產分析純。LC-10Avp高效液相色譜儀，為日本島津公司生產。Morris水迷宮，中國醫學科學院藥物研究所研制。One TouchⅡ血糖儀，美國強生有限公司產品。

1.2 模型制備、動物分組和藥物治療

45只大鼠適應性喂養3 d后，置于Morris水迷宮中學習訓練2 d。于第3天，選擇4次均能在90 s內找到平臺的43只大鼠為合格實驗動物。合格大鼠自由覓食飲水，再喂養3 d后，隨機選出10只為正常對照組。余下的大鼠禁食不禁水12 h，一次性尾靜脈給予STZ 50 mg·kg－1(STZ臨用前溶解于新鮮配制的0.1 mol·L－1，pH 4.4 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，配制成1%的溶液)，記為第0天(d 0)。72 h后由尾靜脈采血測定血糖，選擇血糖≥15.0 mmol·L－1者為糖尿病大鼠[11]。將復制成功的糖尿病大鼠再用隨機法分為2組:糖尿病模型組16只;胰島素治療組13只，每日下午5～6時腹部sc給予胰島素，并于次日上午8～9時檢測血糖，調整胰島素用量，使大鼠血糖控制在 6～9 mmol·L－1，胰島素用量約為每天2 U·kg－1。正常對照組腹部皮下給予等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。所有大鼠均自由攝食攝水，12 h光照，連續給藥82 d。

1.3 大鼠體質量和血糖的測定

每周定期測定1次大鼠體質量。定期檢測大鼠空腹血糖，尾靜脈采血，用血糖儀測定。

1.4 Morris水迷宮實驗

參照Morris方法[12]于第81天進行大鼠水迷宮實驗。記錄大鼠尋找平臺并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)和計算大鼠在原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比。實驗期間繼續給藥。

1.5 HE染色觀察海馬CA1區神經細胞形態

Morris水迷宮實驗結束后，用10%水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射，麻醉后開胸暴露心臟，經左心室插管灌流生理鹽水，剪開右心房，待心臟變白后改用4%多聚甲醛灌流固定，取腦組織，固定于10%甲醛中，石蠟包埋切片，經HE染色后光鏡下觀察海馬CA1區神經細胞形態變化。

1.6 高效液相色譜法檢測海馬組織中谷氨酸和D-絲氨酸含量[13－14]

水迷宮實驗完成后立即取雙側海馬，凍存，5 d內用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)柱前衍生化高效液相色譜法測定谷氨酸和D-絲氨酸含量(mg·g－1濕重)。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 胰島素對糖尿病大鼠體質量和血糖的影響

表1及表2結果顯示，正常對照組大鼠體質量增長明顯，血糖維持正常水平，而糖尿病模型組大鼠體質量增長緩慢或下降，血糖一直處于較高水平(血糖≥15.0 mmol·L－1)，與正常對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.01)。胰島素治療組大鼠體質量增加明顯，血糖也恢復到正常水平(表2)。

2.2 胰島素對糖尿病大鼠空間學習記憶的影響

表3結果表明，糖尿病模型組大鼠逃避潛伏期較正常對照組明顯延長，且在原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比明顯降低(P＜0.01)，表明糖尿病大鼠空間學習記憶功能明顯受損(P＜0.01)。胰島素治療組逃避潛伏期較糖尿病模型組明顯縮短(P＜0.01)，大鼠在原平臺象限的游泳時間占總游泳時間的百分比明顯增加(P＜0.01)，表明胰島素可以明顯改善糖尿病大鼠的學習記憶能力(表3)。

Tab.1 Effect of insulin on body mass in diabetes mellitus(DM)rats

Tab.2 Effect of insulin on blood glucose in DM rats

Tab.3 Effect of insulin on escape latency and percentage of time spent in target quadrant of DM rats

2.3 胰島素對糖尿病大鼠海馬組織病理變化的影響

從海馬冠狀切片HE染色可見，正常對照組(圖1A)、糖尿病模型組(圖1B)、胰島素治療組(圖1C)光鏡下海馬CA1區錐體細胞均排列整齊、密集;神經元形態完整，胞核染色清晰，核圓形或橢圓形，核仁明顯。

Fig.1 Effect of insulin on pyramidal neurons in hippocampal CA1 regions of DM rats(HE staining ×400).See Tab.1 for the rat treatment.A:control group;B:DM model group;C:DM model+insulin group.

2.4 胰島素對糖尿病大鼠海馬組織中谷氨酸和D-絲氨酸含量的影響

表4結果表明，與正常對照組相比，糖尿病模型組海馬組織谷氨酸及D-絲氨酸含量都明顯升高(均P＜0.01)。與糖尿病模型組相比，胰島素治療組海馬組織中谷氨酸及D-絲氨酸含量均顯著降低(P＜0.01)，與正常對照組相比無顯著性差異。

Tab.4 Effect of insulin on levels of glutamate(Glu)and D-serine(D-Ser)in hippocampus of DM rats

3 討論

本研究結果表明，胰島素能夠使糖尿病大鼠血糖恢復到正常水平，體質量也逐漸增加，大鼠無多飲多尿現象。注射STZ第81天進行水迷宮實驗，與糖尿病模型組相比，胰島素治療組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺象限游泳時間占總游泳時間的百分比明顯升高，表明胰島素對STZ誘導的大鼠學習記憶損傷具有治療作用，該結果與文獻報道結果基本一致[11]。

NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，介導多種生理病理變化，其激活需要谷氨酸及D-絲氨酸共同參與。本研究還測定了海馬組織中這2種氨基酸含量，結果表明糖尿病模型組海馬組織中谷氨酸和D-絲氨酸分別是正常對照組的1.39和1.35倍。有文獻報道，糖尿病大鼠谷氨酸生成量增加[15]，與本研究結果基本一致。D-絲氨酸作為哺乳動物體內最主要的D型氨基酸之一，達到了體內游離絲氨基酸總量的三分之一。在體內D-絲氨酸主要由絲氨酸消旋酶將體內的L-絲氨酸轉化而來[10]。有文獻報道，腹腔注射STZ具有提高視網膜絲氨酸消旋酶活性和D-絲氨酸含量的作用[16]，因此推斷STZ在腦組織中也可能通過同樣的機制來提高腦海馬組織中的D-絲氨酸含量。谷氨酸和D-絲氨酸在激活NMDA 受體過程中發揮關鍵性作用[9－10，17]。研究報道，NMDA受體上甘氨酸位點并不飽和[18]，并且能夠被外源性D-絲氨酸進一步激活[19]，因此推測糖尿病模型大鼠學習記憶損傷可能與大鼠海馬組織中谷氨酸及D-絲氨酸含量升高、引起NMDA受體過度興奮有關。而胰島素對糖尿病大鼠學習記憶的治療作用可能是通過降低海馬組織中谷氨酸和D-絲氨酸的濃度，進而發揮了治療作用。

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