槲皮素對大劑量X線暴露所致PC12細胞氧化性損傷的保護作用

喻 晶，張繼青，葛 寧，刁 波，張 宜，陳福慈，呂 玲，羅遠菊，劉 宏

(廣州軍區武漢總醫院1.藥劑科，3.腫瘤放療科，4.醫學實驗科，湖北武漢 430070;2.湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢 430065)

隨著核能在國民經濟和軍事領域中的廣泛應用，各種輻射事故和災難導致的放射性物質泄漏時有發生。人體在短時間內暴露于大劑量射線輻照環境中，會誘導產生具有強氧化活性的自由基，使細胞膜、DNA和蛋白質等生物大分子發生脂質過氧化[1－3]，引起直接受照組織和細胞的輻射損傷。因此，從防護的角度減少或淬滅輻射誘導的自由基，終止或抑制其對生物組織和細胞產生的氧化性損傷一直是輻射防護研究的核心問題之一[4]。槲皮素(quercetin)是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和茶葉中[5]，具有顯著的抗氧化和清除自由基的作用[6－7]。本研究從細胞水平探討槲皮素對大劑量輻射所致PC12細胞氧化性損傷的保護作用及其可能的作用機制，以期為黃酮類化合物在神經系統輻射防護方面的研究和利用積累資料。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

槲皮素(批號:QU20101102，純度98.7%)購自鄭州荔諾生物科技有限公司。DMEM高糖培養基購自Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自NQBB公司;胰蛋白酶購自Amresco公司;噻唑藍(MTT)購自Biosharp公司;二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和總抗氧化能力(total antioxidative capacity，T－AOC)測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。Precise e1293醫用直線加速器，瑞典ELECTA公司;RT－6500酶標分析儀，中國深圳雷杜生命科學股份有限公司;2120 UV紫外分光光度計，韓國QPTIZEN公司;F－4500熒光分光光度計，日本 Hitachi公司;CK2－TR倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 細胞培養和藥物配制

PC12細胞為神經生長因子誘導分化型，由本院醫學實驗科保存。細胞用含10%FBS，青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 mg·L－1的 DMEM 高糖培養液，以1.0×108L－1密度接種于培養瓶中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱內常規培養。取對數生長期的細胞進行實驗。將槲皮素溶于DMSO，配成100 mmol·L－1儲備液，－20℃保存，使用時用DMEM高糖全培養液稀釋至實驗濃度。

1.3 MTT法檢測細胞增殖反應

將PC12細胞以1.0×108L－1的密度接種到96 孔板，每孔100 μl，待細胞90%融合后，加入槲皮素 6.25，12.5，25，50 和 100 μmol·L－1分別作用24，48和72 h，吸棄原培養液，PBS洗2次，每孔加入濃度為 5 g·L－1MTT 20 μl，于 37℃，5%CO2培養箱內繼續培養4 h后，吸棄各孔MTT加入DMSO 100 μl，充分振搖培養板，用酶標儀測定波長492 nm處吸光度(A)值。每組設6復孔。

PC12 細胞與槲皮素 12.5，25 和 50 μmol·L－1預作用2 h后接受照射。本課題組采用從1～9 Gy多個輻射劑量進行了預實驗，發現PC12細胞在經4 Gy X線輻照24 h后細胞周期出現明顯的G0/G1期阻滯，故本研究在此基礎上選取4 Gy X線，從輻照所致PC12細胞氧化性損傷的角度探討槲皮素的輻射防護效果。照射條件:采用6 MeV X線，照射劑量為4 Gy，劑量率為2 Gy·min－1，皮靶距為60 cm，照射野為20 cm×20 cm。同時設正常對照組和輻射對照組。每組設6復孔。各組于照射后24 h用上述MTT法檢測細胞增殖反應。

1.4 細胞SOD活性、MDA和ROS含量及T－AOC檢測

將生長狀態良好的細胞進行消化、計數，調整細胞密度為1.0×108L－1，接種到5個培養瓶中，每瓶5 ml，待細胞90%融合后，隨機分成正常對照組、輻射對照組(4 Gy)、輻射 +槲皮素 12.5，25 和50 μmol·L－1組。PC12 細胞與槲皮素預作用 2 h 后再接受照射。照射條件同上。各組均于照射后24 h收集細胞，－80℃保存，備用。細胞常溫裂解30 min后，混勻，取混懸液，用黃嘌呤氧化酶法檢測細胞SOD活性，硫代巴比妥法檢測MDA含量，菲啉絡合法檢測T－AOC，DCFH－DA探針法檢測ROS含量，嚴格按照檢測試劑盒說明書操作。ROS含量用熒光強度表示。以上實驗重復3次。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 槲皮素對PC12細胞增殖反應的影響

與正常對照組比較，槲皮素在作用24 h(r=0.887，P＜0.01)和 48 h(r=0.872，P＜0.01)，PC12細胞增殖反應隨槲皮素濃度的增加而增高;作用72 h，槲皮素對PC12細胞增殖反應具有明顯的抑制作用，并隨槲皮素濃度的增加抑制作用增強(r=0.942，P＜0.01)(表1)。

Tab.1 Effect of quercetin on PC12 cell proliferation in vitro

2.2 槲皮素對輻射損傷PC12細胞增殖反應的影響

由表2可以看出，與正常對照組比較，PC12細胞受輻射后細胞增殖反應明顯降低(P＜0.01)。與輻照對照組比較，槲皮素12.5，25 和 50 μmol·L－1防護組PC12細胞增殖反應明顯增強(P＜0.05，P＜0.01)，且具有濃度效應關系(r=0.751，P＜0.01)。

Tab.2 Effect of quercetin on proliferation of PC12 cells injured by X－ray in vitro

2.3 槲皮素對輻射損傷PC12細胞SOD活性、MDA含量、T－AOC和ROS的影響

由表3可以看出，與正常對照組比較，PC12細胞受輻射后SOD活性和T－AOC降低(P＜0.01)，MDA和ROS含量增加(P＜0.01)。與輻照對照組比較，槲皮素 12.5，25 和 50 μmol·L－1防護組PC12細胞 SOD 活性(r=0.837，P＜0.01)和T－AOC(r=0.940，P＜0.01)隨槲皮素濃度增高而增高，MDA 含量(r=0.845，P＜0.01)和 ROS 含量(r=0.930，P＜0.01)隨槲皮素濃度的增高而降低，表明槲皮素對PC12細胞的輻射防護作用具有濃度效應關系。

Tab.3 Effect of quercetin on superoxide dismutase(SOD)，malonedialdehyde(MDA)，total anti－oxidation capacity(TAOC)and reactive oxygen species(ROS)of PC12 cells injured by X－ray in vitro

3 討論

據報道，槲皮素能減輕γ射線照射誘導的人外周血淋巴細胞的 DNA 損傷，其濃度在24 μmol·L－1時防護效果最佳[8]。槲皮素濃度＜100 μmol·L－1時對人視網膜色素上皮細胞的氧化性損傷具有保護作用，但濃度＞100 μmol·L－1時作用 24 h 后出現明顯的細胞毒性[9]。本研究結果表明，槲皮素≤100 μmo·lL－1時作用24和48 h對PC12細胞具有促增殖作用，槲皮素≥12.5 μmol·L－1時作用72 h抑制細胞增殖，表現出明顯的細胞毒性。由此可見，槲皮素對細胞增殖反應的影響具有雙向性，且呈濃度依賴關系，與文獻報道一致[10]。此作用機制可能是因外界刺激后導致細胞培養液中過氧化物的蓄積所致[11]。

電離輻射作為一種高能物理損傷因素，可通過電離激發機體產生大量自由基，當自由基產生過多而不能及時地清除時就會引起一系列的輻射損傷[12－13]，脂質過氧化產物MDA含量可反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度，SOD活性則反映細胞清除自由基的能力，兩者間接體現出輻照后細胞內氧化損傷體系的強弱。本研究結果表明，X線輻射PC12細胞后胞內ROS增加、發生脂質過氧化、SOD 活性和T－AOC下降。槲皮素 12.5，25 和50 μmol·L－1均表現出明顯的抗輻射效果，其抗輻射作用與槲皮素濃度呈良好的相關性。據報道，Na+/K+/2Cl－協同轉運蛋白可能參與調控槲皮素對PC12細胞的生長分化[14]，其是否也參與槲皮素對輻射所致PC12細胞氧化性損傷的防護機制的調控有待研究。

本研究僅從槲皮素對輻射所致PC12細胞氧化性損傷的角度說明其具有一定的輻射防護作用，但這種神經保護作用可能還與誘導細胞凋亡、調控細胞周期和調節胞內信號等作用機制有關，故槲皮素輻射生物學作用的機制還有待更深層次的研究。此外，槲皮素是否能應用于臨床放療前或放療中對非靶點組織的輻射防護，還需要更多的細胞學、實驗動物學甚至臨床實驗等來驗證。

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