丹皮酚體外對肝星狀細胞增殖和凋亡的影響

魏東華，孔德松，張自力，倪春艷，張雪嬌，鄭仕中，3

(1.哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)藥學院，黑龍江大慶 163319;2.南京中醫(yī)藥大學中藥學一級學科，江蘇南京 210046;3.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210046)

肝纖維化是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復過程中的代償反應(yīng)，其實質(zhì)是肝內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成大于降解導致大量ECM過度沉積[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化增殖是肝纖維化進程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HSC是肝ECM的主要來源，是肝纖維化形成的細胞學基礎(chǔ)，在ECM代謝和多種細胞介質(zhì)產(chǎn)生過程中處于中心地位。抑制HSC增殖、減少活化HSC數(shù)量并誘導HSC的凋亡將有利于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)[2]。

丹皮酚(paeonol)是毛莨科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮和蘿摩科植物徐長卿〔Cynanchum paniculatum(Bge.)Kitag.〕干燥根及根莖的主要有效成分。丹皮酚是一種小分子的酚類化合物，分子式為C9H10O3，化學結(jié)構(gòu)是2-羥基4-甲氧基苯乙酮。丹皮酚具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及保護心腦血管等廣泛的藥理活性[3－5]。近期研究表明，丹皮酚對人肝癌細胞增殖具有抑制作用，對多種慢性肝病和病毒性肝炎也具有良好的治療作用[6－8]。本研究主要觀察丹皮酚體外對HSC增殖抑制和凋亡誘導作用，初步探討丹皮酚抗肝纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞、主要試劑和儀器

丹皮酚，寧波天真制藥有限公司。HSC細胞，上海肯強實業(yè)有限公司。DMEM培養(yǎng)基和小牛血清，美國Gibco公司;胰蛋白酶，韓國BioSHARP公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測定試劑盒，南京建成生物工程研究所;Hoechst染色試劑盒，海門碧云天生物技術(shù)研究所;AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒，南京凱基生物。光學顯微鏡，德國萊卡公司;超低溫冰箱，美國紐艾爾公司;CO2細胞培養(yǎng)箱，美國 FORMA公司;FACS Salibur型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

HSC細胞接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入適量的高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%小牛血清)，于5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代時用0.25%胰酶消化，細胞生長至70%～80%融合率進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞存活

取生長狀態(tài)良好的HSC，用胰蛋白酶消化成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔5×103細胞。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，細胞分為對照組和藥物組，對照組加入含有0.4%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，藥物組加入丹皮酚使其終濃度分別為1.66，3.32，8.3，16.6，33.2 和 49.8 mg·L－1，每孔培養(yǎng)體積180 μl，每組設(shè)6復孔。培養(yǎng)48 h后，于各孔分別加入 20 μl的 MTT 溶液(0.5%)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，4 h 后加入 200 μl DMSO，在微型振蕩器震蕩10 min后，用全自動酶標儀在490 nm波長處測定各孔A值。對細胞存活的抑制率(%)=(1－A藥物組/A對照組)×100%。

1.4 錐蟲藍染色法檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期HSC，加入丹皮酚，終濃度分別為1.66，8.3，16.6，33.2 和49.8 mg·L－1，于5%CO2，37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入錐蟲藍，顯微鏡下計數(shù)活細胞，計算細胞存活率，觀察丹皮酚抑制HSC存活的濃度效應(yīng)關(guān)系。丹皮酚33.2 mg·L－1與 HSC 孵育 6，12，24，36 和48 h，用錐蟲藍染色法測定細胞存活率，觀察丹皮酚抑制HSC存活的時間效應(yīng)關(guān)系。

1.5 LDH釋放實驗檢測細胞毒性

取生長狀態(tài)良好的HSC細胞，用0.25%的胰酶消化成細胞懸液，接種于96孔板中，每孔5×103細胞。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含有0.4%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基和丹皮酚，丹皮酚終濃度分別為 1.66，3.32，8.3，16.6，33.2 ，49.8 和 69.7 mg·L－1，每孔總體積 200 μl，每組設(shè)6復孔。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48h后輕輕吸取細胞上清，按試劑盒說明書測定LDH活性。實驗重復3次。

1.6 細胞形態(tài)學觀察

將嚴格清潔、浸酸、消毒的潔凈蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板中，加入HSC 5×107，置37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞爬于蓋玻片后，分別加入丹皮酚，丹皮酚終濃度為16.6，33.2 和49.8 mg·L－1，同時設(shè)DMEM培養(yǎng)基對照組，于24 h分別于顯微鏡下觀察，拍照，觀察細胞形態(tài)變化。

1.7 Hoechst染色檢測細胞凋亡

取潔凈蓋玻片在75%乙醇中浸泡5 min，無菌超凈臺內(nèi)吹干，再用細胞培養(yǎng)液洗滌1次。將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，加入細胞培養(yǎng)過夜，在蓋波片上長滿至50%～80%。丹皮酚終濃度分別為1.66，8.3，16.6，33.2 和 49.8 mg·L－1，與細胞孵育24 h。參考Yuan等[9]方法進行Hoechst染色。于熒光顯微鏡下檢測，激發(fā)波長350 nm。

1.8 流式細胞儀測定細胞凋亡率和細胞周期

將生長良好的 HSC用0.25%胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)液懸浮細胞，接種于6孔板中，每孔3×105細胞。待細胞貼壁，呈單層融合后(約12 h)，棄去上清液，更換為含0.4%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，并加入丹皮酚，使其終濃度分別為1.66，8.3，16.6，33.2和49.8 mg·L－1，培養(yǎng)24 h 后用不含EDTA的胰酶收集細胞，PBS洗細胞2次，收集(1～5)×105細胞，按試劑盒說明分別加入AnnexinⅤ/PI雙染試劑，避光作用5～15 min后用流式細胞儀測定細胞凋亡率。實驗重復3次。

細胞給藥濃度同HSC凋亡率檢測，培養(yǎng)48 h后用0.25%的胰酶收集細胞，PBS洗細胞2次，70%乙醇過夜固定。收集(2～3)×104細胞，按試劑盒說明分別加入PI單染試劑，避光作用5～15 min后用流式細胞儀測定細胞周期，實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對HSC存活率的影響

表1結(jié)果表明，丹皮酚對HSC存活具有明顯抑制作用，且具有濃度效應(yīng)關(guān)系(r=0.955，P＜0.05)，作用48 h 時 IC50值為105.4 mg·L－1。圖1結(jié)果表明，丹皮酚對HSC存活的抑制作用不僅具有濃度效應(yīng)關(guān)系(r=－0.936，P＜0.05)，在濃度為33.2 mg·L－1時還具有時間效應(yīng)關(guān)系(r=－0.965，P＜0.05)。

Tab.1 Inhibition of paeonol on hepatic stellate cell(HSC)survival

Fig.1 Effect of paeonol on HSC viability assayed by trypan blue dye.A:HSC were treated with paeonol for 48 h.B:HSC were treated with paeonol 33.2 mg·L－1for 6，12，24，36 and 48 h.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control(0)group.

2.2 丹皮酚對HSC的細胞毒性作用

LDH釋放實驗結(jié)果表明，丹皮酚在1.66～69.7 mg·L－1作用 48 h，HSC 細胞培養(yǎng)上清 LDH活性與對照組比較無明顯變化(圖2)，表明在此濃度范圍內(nèi)丹皮酚對HSC無細胞毒性。

2.3 丹皮酚對HSC凋亡形態(tài)的影響

Fig.2 Effect of paeonol on lactate dehydrogenase(LDH)release of HSC cells.HSC were treated with paeonol 1.66 －69.7 mg·L －1for 48 h，then LDH activity in culture supernatant was detected by LDH activity detection kit.

顯微鏡下，對照組HSC細胞形狀不規(guī)則，胞體呈卵圓形或不規(guī)則形，常伸出數(shù)個星狀突起，貼壁生長良好(圖3A)。丹皮酚 16.6～49.8 mg·L－1作用24 h，細胞胞體變小，變圓，貼壁細胞數(shù)目減少，胞漿透亮度下降，顆粒感增強，部分細胞胞突回縮變圓，脫落呈懸浮狀，細胞膜崩潰，可見細胞碎片(圖3B，C，D)。熒光顯微鏡下可見丹皮酚在1.66～49.8 mg·L－1濃度范圍內(nèi)，HSC有細胞核破碎、固縮、邊緣化等凋亡特征的出現(xiàn)，并且隨著濃度增加，凋亡細胞也明顯增多(圖4)，表明丹皮酚具有促進HSC細胞凋亡的作用。

Fig.3 Effect of paeonol on morphological changes of HSC(DAB，×100).HSC were incubated with paeonol for 24 h，morphological changes were observed under a Leica microscope.↑:cell debris.A:control;B，C and D:paeonol 16.6，33.2 and 49.8 mg·L－1.

2.4 丹皮酚對HSC凋亡和細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果表明，丹皮酚1.66～49.8 mg·L－1作用24 h能夠顯著促進 HSC 凋亡，且具有濃度效應(yīng)關(guān)系(r=0.920，P＜0.05)(圖5，表2)。同時發(fā)現(xiàn)，丹皮酚 33.2 和49.8 mg·L－1作用48 h可調(diào)節(jié)細胞周期，G0/G1期細胞增加(P＜0.01)，S 期細胞減少(P＜0.01)，具有濃度效應(yīng)關(guān)系(r=0.980，P＜0.05)(圖6，表2)。

Fig.4 Effect of paeonol on apoptosis characteristics of HSC(Hoechst 33258，×200).↑:apoptotic HSC.A:control;B－F:paeonol 1.66，8.30，16.6，33.2 and 49.8 mg·L －1for 24 h.

Fig.5 Effect of paeonol on apoptosis of HSC detected with flow cytometry of annexinⅤ-FITC/PI double-staining.See Fig.4 for the cell treatment.A:control;B －F:paeonol 1.66，8.30，16.6，33.2 and 49.8 mg·L－1for 24，respectively.

Fig.6 Effect of paeonol on cell cycle of HSC analyzed by flow cytometry.A:control;B －F:paeonol 1.66，8.30，16.6，33.2 and 49.8 mg·L －1for 48 h，respectively.

Tab.2 Effect of paeonol apoptosis and cell cycle of HSC

3 討論

持續(xù)的肝損傷可損害肝實質(zhì)細胞和枯否細胞，這些細胞可分泌多種細胞因子并產(chǎn)生活性氧，激活處于靜止期的HSC，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉置谀z原能力更強的肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)，致使ECM大量沉積，形成肝纖維化[2]。研究表明，抑制HSC激活或促進其凋亡可逆轉(zhuǎn)肝纖維化，且臨床患者在進行相關(guān)肝纖維化的診治時大都已處于肝纖維化中晚期，此時患者體內(nèi)存有大量的活化型 HSC和MFB，造成肝纖維化持續(xù)惡化。因此，研究促HSC凋亡的藥物及其作用機制可能更具實用價值，抑制HSC增殖、誘導其凋亡的藥物也將成為抗肝纖維化治療的重要手段[10]。

近年來，隨著研究的深入，中藥天然產(chǎn)物丹皮酚新發(fā)現(xiàn)的藥理作用逐漸引起人們的注意。丹皮酚可誘導在體小鼠肝癌細胞凋亡，降低Bcl-2/Bax比值，而且升高其脾細胞和巨噬細胞活化后白細胞介素2和腫瘤壞死因子α的表達[11]。丹皮酚能夠顯著抑制乙醇灌胃導致的大鼠酒精性肝損傷，降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性，減少肝細胞脂肪變性、炎癥細胞浸潤及肝細胞凋亡[12]。在一些治療慢性肝炎的中藥復方制劑如復方益肝丸和肝康復等中，丹皮酚是這些藥物發(fā)揮藥效作用的重要成分和藥物質(zhì)量的檢測標準[13－14]。丹皮酚對上述各種肝損傷具有良好的改善作用，那么丹皮酚是否在抗肝纖維化方面也有突出作用，其對HSC的作用又是如何，是否可以像對上述肝癌細胞那樣抑制HSC的增殖并誘導其凋亡，至今未見相關(guān)報道。本研究重點闡述丹皮酚對HSC增殖和凋亡的影響，為開發(fā)新型、有效抗肝纖維化藥物提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，丹皮酚可抑制HSC增殖，表現(xiàn)為細胞形態(tài)和細胞存活率的改變。進一步研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可誘導HSC凋亡。另外，丹皮酚對HSC細胞增殖抑制作用主要在于其能使細胞由G0/G1期進入S期的過程受阻，導致G0/G1期細胞增加，處于S期與G2/M期的細胞則相應(yīng)減少，同時細胞的凋亡率明顯增加。目前認為細胞周期有2個突發(fā)性的轉(zhuǎn)折點:G1→S及G2→M期[15]。因此可以認為，丹皮酚對于細胞周期的G1→S重要轉(zhuǎn)折點的調(diào)控作用可能是抑制HSC細胞增殖的關(guān)鍵所在，提示丹皮酚抗肝纖維化的作用可能是通過影響HSC的增殖周期并誘導其凋亡實現(xiàn)的。

經(jīng)過眾多研究者多年來不斷深入的研究，人們對HSC增殖與凋亡的機制已日漸了解，并已發(fā)現(xiàn)一些可抑制HSC增殖、促進其凋亡的藥物。如膠霉毒素(gliotoxin)、蘆薈布洛芬(aloeemodin)和丹參酮(tanshinone)等可通過影響線粒體凋亡途徑誘導HSC凋亡;姜黃和羅西格列酮(rosiglitazone)抑制HSC增殖的效應(yīng)是通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ實現(xiàn)的;柳氮磺吡啶(sulfasalazine)等通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子2JB途徑來促進HSC凋亡;中藥紅花(Carthamus tinctorius)可促進Fas活化[16－17]。HSC的增殖與凋亡調(diào)控是一個復雜的過程，不同藥物可通過不同的途徑或多途徑同時發(fā)揮促HSC凋亡的作用。本研究只是從細胞水平闡明丹皮酚可以影響HSC的增殖周期，促進其凋亡，其具體分子機制及其與其他藥物相比的作用效果和作用方式等仍需深入研究。

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