擬南芥GA2ox基因家族啟動子分析

段秋紅，趙小英，賀熱情，郭 明，劉德榮，唐冬英，劉選明

(湖南大學生物學院，湖南長沙410082)

赤霉素(Gibberellin，GA)是一類雙萜物質，是常見植物激素之一。目前已發現赤霉素類物質136種［1－3］。其中少數 GA 具有生物活性，如 GA1、GA4等，其他生物形態的GA只是在赤霉素的合成過程中起著中間產物的作用，其本身并沒有太大功能［4－5］。具有生物活性的 GAs影響植物的整個生命周期，如影響種子的萌發、莖的生長、花的發育和果實的成熟［6］。GA2-氧化酶(GA2-oxidase)，作用于有生物活性的GA1和GA4，使兩者在C-2位羥基化轉變成無活性的GA8和GA34，通過減少GAs的水平來調節植物的生長，如使植物矮化、節間縮短［7－8］。擬南芥GA2ox是由8個(GA2ox1－8)成員編碼的雙加氧酶，每個基因所參與的調控不同。一些GA2ox編碼的蛋白參與植物光形態建成，光通過誘導GA2ox基因的表達降低植物體內有生物活性的GA4而促進光形態建成［9－11］;部分編碼的蛋白具有催化植物激素(如吲哚乙酸、水楊酸等)與氨基酸聯結的功能［12－13］，可能參與植物體內的激素代謝和逆境脅迫響應過程。

真核基因的表達與調控是涉及多個基因、多條信號途徑及多基因產物的復雜過程。從轉錄及轉錄后水平、翻譯及翻譯后水平、蛋白質加工水平對基因的表達進行精細調控［14］，首先是由啟動子與轉錄因子在轉錄水平上的表達調控，因此啟動子的作用十分關鍵。本研究提取了擬南芥GA2ox基因家族的啟動子以及蛋白質序列，利用生物信息學分析軟件構建進化樹，對蛋白模體和順式元件進行分析，探討基因定位、進化關系、蛋白模體同源性以及順式元件的保守性，了解高保守順式元件與GA2ox基因表達調控的相關性，詳細分析了各類激素如何調控GA2ox基因的表達，為后續GA2ox基因表達調控的研究提供了依據。

1 材料與方法

1.1 蛋白質與啟動子序列的確定

從TAIR網站獲得GA2ox基因家族的全基因組序列、CDS序列和蛋白質序列，并取得染色體、外顯子、內含子信息，同時獲取翻譯起始密碼子上游1 500 bp序列，用于對GA2ox基因家族的啟動子分析。

1.2 蛋白模體獲取與進化樹構建

利用MEME在線分析GA2ox蛋白模體，設置模體長度最大為300、最小為6，模體最多設為10。將獲得的GA2ox氨基酸序列構建進化樹，其聚類結果利用 MEGA5繪制進化樹［15］。

1.3 順式元件分析

從PLACE在線分析GA2ox基因上游1 500 bp啟動子序列，獲取GA2ox基因高同源性以及特異性的順式元件。利用DMB序列局部比對分析軟件，設置上游元件長度最大為12 nt、最小為5 nt，每個長度尋找元件最多設為15，分析選擇EM2模式，對105個模體進行分析［16］。利用 Plant CARE分析與PLACE以及DMB共同的保守元件。

1.4 基因芯片分析

利用 BAR HeatMapper tool、AtGenExpress Visual-ization Tool、PLEXdb以及 NCBI網站，獲取 GA2ox基因家族的各個組織器官的表達量以及不同激素處理下GA2ox表達量的變化。

2 結果和分析

2.1 AtGA2ox基因家族染色體定位、內含子和外顯子分布

在擬南芥中有 8個完整的 GA2ox基因，因GA2ox5為假基因，所以只對7個GA2ox基因進行染色體定位分析，結果表明，該家族五個基因定位在1號染色體上，GA2ox3分布在4號染色體上，GA2ox8分布在2號染色體上(見圖1c)。外顯子和內含子分析顯示GA2ox基因具有相似的內含子和外顯子結構，均為2個內含子和3個外顯子，且外顯子的長度變化較小(見圖1a、b)。GA2ox基因染色體定位與外顯子、內含子結構分布的保守性，可能存在某些功能的相似性。

2.2 AtGA2ox基因家族進化關系

根據擬南芥GA2ox基因氨基酸序列構建進化樹，并對蛋白模體進行比對分析(見圖2)。擬南芥GA2ox基因家族可以分為兩亞類:一類作用于C19-GAs的 AtGA2ox1－6，AtGA2ox1－3的親緣關系較近，而AtGA2ox4，6與前3條序列親緣關系較遠;另一類作用于C20-GAs的AtGA2ox7－8［8］，說明擬南芥中同時存在2種具有不同特異性的GA2-氧化酶。蛋白模體分析表明，GA2ox基因家族10個蛋白模體結構基本類似，預示該家族在進化上可能具有一定的保守性，同時進化關系越相近的亞類，其模體同源性越高，且模體結構位置分布更接近，這些差異也說明為什么GA2ox基因家族兩個亞類具有不同功能。

2.3 AtGA2ox基因家族啟動子順式元件特性

2.3.1 保守順式元件

利用DMB分析GA2ox基因家族得到105個保守序列，出現頻率大于70%(在5條以上序列中出現)的保守序列共有38個，約占36%。有21個保守序列可在PLACE數據庫中找到相應的順式元件(見表1)，諸多保守元件是與組織或器官特異性表達相關，調控基因在根、莖、葉、花、種及胚中的表達。其中NODCON1GM是與根瘤菌有關的特異性保守序列，在植物細胞被感染后對基因轉錄起調節作用;ARRlAT和CPBCSPOR與細胞分裂素有關，參與細胞分裂素的應答調節［17－18］;DOFCOREZM 能與 Dof蛋白結合，參與碳代謝途徑［19］;GT1CONSENSUS具有能與GT－1結合的保守序列，是典型的植物光調控元件;IBOXCORE元件可能參與光信號調控途徑;ANAER-O1CONSENSUS位于厭氧應答基因上游調控區，可 能 參 與 厭 氧 基 因 的 表 達 調 控［20］;MYB1CORE能被植物抗旱元件MYB識別，且參與植物的苯丙素代謝以及植物生長發育的調控［21－24］;WBOXATNPR1是與傷害防御相關的元件;而BIHD1OS、CCAATBOX1 是與脅迫響應相關的元件［25］。

圖1 擬南芥AtGA2ox基因家族的染色體定位以及外顯子、內含子分布圖Fig.1 The chromosome and exon-intron location of AtGA2ox gene family

圖2 擬南芥AtGA2ox基因家族的進化樹以及蛋白模體分布Fig.2 Phylogenetic tree and protein motifs location of AtGA2ox gene family

Plant CARE分析結果表明GA2ox基因上游啟動子除TATA-box、CAAT-box等真核生物啟動子結構元件外，還存在諸多保守元件(見圖3)，與DMB和PLACE軟件分析一致。綜上所述，GA2ox基因啟動子存在光、耐旱、耐低溫、防御元件以及增強基因的轉錄活性相關元件;還存在脫落酸(Abscisic acid，ABA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)、茉莉酸(Jasmonate，JA)、乙烯(Ethyl-ene，ET)、生長素(Auxin，IAA)、赤霉素等激素以及生物鐘響應元件等。

2.3.2 與光相關的順式元件

由圖3可知，GA2ox家族每個基因中至少存在8個光順式作用元件，且均勻分布在上游1 500bp啟動子調控區。所有基因中都存在著一些典型的光元件，如:G-box與GT1，此類元件對于維持啟動子功能與調控GA2ox基因轉錄是起非常重要的作用。一部分光元件僅存在于進化關系相近的GA2ox基因家族中，如:分布在 C19-GAs亞類的 SP1，僅存在于GA2ox1－3啟動子中的 ATCT-motif、LS7、chs-CMA1a 以及BoxⅡ。部分光元件(如G-box)必須和其它的光元件組合才能使啟動子具有光調節特性，且類型和數量不同的光元件具有不同光調控特性［26］，因此GA2ox基因家族光元件種類、數量及與彼此之間的距離，可能影響各個基因的轉錄造成不同光調控 特性。

表1 AtGA2ox基因家族啟動子保守順式元件統計Table 1 Conservative cis-elements statistics of AtGA2ox gene family

圖3 AtGA2ox基因家族啟動子保守順式元件分布Fig.3 Conservative cis-elements location of AtGA2ox gene family

2.3.3 與植物激素和脅迫相關的順式元件

除諸多光保守元件外，在GA2ox基因啟動子序列中還發現許多與激素和脅迫相關的元件，如表2和圖3所示。現從中選取較為典型的順式元件進行分析。由表2可知分布較廣的為ABA、IAA和ET響應元件，所有基因均存在ET和IAA響應元件，共分布 11個 ERELEE4，而 GA2ox3則含有 4個ERELEE4;6個GA2ox基因家族中存在11個ABA元件ABRELATE-RD1，其中GA2ox2和GA2ox7含有3個此元件;GA2ox基因家族有5個成員含GA和JA響應元件，且JA元件達到14個。同時脅迫響應元件MYB、Wbox等存在于所有基因中。有研究發現植物體內激素可以作為“逆境激素”［27］，在植物抗鹽、抗旱和抗寒的生理過程中起作用，因此，當植物處于高鹽、干旱和低溫脅迫下，誘導啟動子脅迫響應元件的表達，同時也可能誘導激素響應元件，共同調控GA2ox的表達。

2.3.4 其他順式元件

在研究GA2ox基因順式元件與該家族的進化關系時，發現除光元件以外，其它順式元件在進化關系選擇上也具有一定規律性。如:與溫度調控相關的元件LTR僅存在于GA2ox1－2以及GA2ox8啟動子中;CTAG-motif元件僅分布在 GA2ox1和 GA2ox3中;真菌誘導響應元件Box-W1僅出現在GA2ox4和GA2ox6中。同時，GA20x基因各自存在一些獨特的功能元件，如:GA2ox1的 ACE元件;GA2ox6的MRE、HD-Zip1以及HD-Zip2元件;GA2ox3的P-box元件等。因此，GA2ox啟動子既存在諸多保守元件，又具有自身特異性元件，說明啟動子部分區域序列呈現多態性，在基因進化選擇時也可能因特異啟動子調控基因的表達模式不同而出現差異。

2.4 AtGA2ox基因家族表達譜

利用基因芯片對AtGA2ox基因家族的分析表明(見圖4)，GA2ox各個基因在種子、根、葉、花以及果莢中都有表達，其中GA2ox1、GA2ox3和GA2ox4在花和果莢中表達量高，GA2ox2在老葉中表達量較高，GA2ox6、GA2ox8在根、葉中表達量較高，而GA2ox7在下胚軸中表達量高。數據表明，GA2ox基因在不同發育階段以及不同組織部位的表達均可能受到嚴格的控制，且與GA2ox存在大量的組織器官順式元件分析結果保持一致(見表1)。

圖4 擬南芥AtGA2ox基因家族組織器官相對表達量Fig.4 Tissue and organ-specific expression of AtGA2ox genefamily

表2 AtGA2ox基因家族啟動子中與激素相關的元件Table 2 The phytohormone cis-elments of AtGA2ox gene family promoter

為研究GA2ox大量的激素響應元件是如何調控基因的表達，我們選取了芯片數據庫10 μM ABA、ACC以及1 μM GA、MJ、IAA分別處理擬南芥野生型0 h、0.5 h、1 h、3 h 的 GA2ox表達數據(見圖5)，結果顯示，GA2ox8和GA2ox6在IAA處理后上調表達，而其他基因在處理后均下調，其中對IAA最敏感的是含有2個生長素響應元件的GA2ox6，而不含生長素響應元件的GA2ox3其表達也下調，這說明IAA誘導生長素響應元件的表達對植物生長的重要性，同時也可能存在其他未被鑒定的生長素響應元件。

ABA上調GA2ox6和GA2ox7基因的表達，而下調其他基因。除GA2ox3，茉莉酸合成前體茉莉酸甲酯(MJ)和乙烯合成前體 1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC)均能降低GA2ox基因的表達。在GA處理下，所有GA2ox表達降低，但隨著處理時間延長，其表達微升。在外源赤霉素的處理下，會促進有生物活性的GA1和GA4積累，而使GA失活的GA2ox基因表達會降低，但持續處理下，植物體內復雜的負反饋調控機制可能會起作用，因此致使大部分GA2ox在3 h出現一定的上調。

在各類激素處理后，GA2ox基因家族表達量均受到不同程度的影響，這與啟動子中含有ABA、GA、IAA、JA和ET響應元件的分布結果基本相吻合。

3 討論

擬南芥GA2ox基因家族集中分布在1號染色體上，內含子和外顯子的結構分布具有高相似性，蛋白序列具有高保守性，其進化關系較近的模體結構分布位置基本相同。GA2ox基因上游啟動子區域內存在大量光響應元件，但一部分光元件僅分布在進化關系相近的基因中，同時各個基因都具有自身特異性的順式元件。這說明GA2ox無論是蛋白還是啟動子都具有高保守性，預示基因功能可能具有相似性;同時特異順式元件調控不同基因的表達對揭示其進化關系也將提供有價值的線索。

圖5 AtGA2ox基因表達對吲哚乙酸、脫落酸、ACC、茉莉酸甲酯和赤霉素處理的響應Fig.5 Expression of AtGA2ox in response to IAA，ABA，ACC，MJ and GA treatments

由GA2ox基因家族表達譜可知，在各類激素條件處理后，GA2ox表達量均受到不同的程度的影響。這些影響說明GA2ox不僅僅是赤霉素代謝途徑中的關鍵酶［11］，同時涉及激活水楊酸、吲哚乙酸和脫落酸信號途徑，并響應茉莉酸以及乙烯元件的調控。在相同激素處理下，GA2ox基因家族成員所受調控不同，如在ABA、IAA處理后，GA2ox6基因的表達上調，但下調GA2ox1－4，這說明GA2ox的順式元件不但可以作為正調控元件，在環境脅迫下，誘導GA2ox家族部分基因的表達，而且還能作為負調控元件，抑制其他基因的表達［27］。

除各類激素元件外，GA2ox啟動子區還存在各種響應生物及非生物脅迫的順式元件，如光、耐鹽、耐旱、溫度、傷害防御等相關元件。當植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫時，會涉及多個信號途徑，并且會形成一套完整的防御機制，而這套完整的機制可能因生物和非生物脅迫響應元件的不同調控起作用［26－30］。有研究者發現 IAA 元件需要 G-box和TGA-box等協同作用［31］;ABA元件兩側都存在影響其活性的G-box［32］;而光元件G-box必須和其他元件相互作用才能發揮其特性［26］;與植物抗逆反應相關的ABA、SA 元件［33］，需要在 MYB、BIHD1OS 等元件的協調下，才能作為“逆境激素”起作用［27，34－35］。因此，在環境信號刺激下，各類順式元件協同起作用，特異性地調控GA2ox基因在植物體內的表達，提高植物對環境脅迫的適應能力，同時各類順式元件的互作也說明GA2ox基因表達調控的復雜性。

此外，部分擬南芥GA2ox基因家族成員，在啟動子區并未預測到含有某類激素應答元件，但在相應激素處理后其表達也受到調控。如不含IAA和ABA元件的GA2ox3，在這兩類激素處理下，其表達量均下調，這可能由于GA2ox3上游啟動子存在其他未被鑒定的激素元件，或是由于GA2ox3啟動子元件的種類、數量及彼此之間的距離對GA2ox3轉錄影響的結果［14］，同時也可能是GA2ox基因家族各成員的啟動子存在相互調控或是結合多個轉錄因子的結果［26］，具體弄清GA2ox基因啟動子的調控機制，還需大量的實驗證據。

保守順式元件調控基因的表達和啟動子元件的多元化，以及與啟動子結合的轉錄因子的多樣性，決定了啟動子的作用機制是一個十分復雜的過程［26］。而GA2ox基因啟動子中的生物脅迫和非生物脅迫響應元件具體是如何行使其功能的?是獨立還是互作?若是互作，與其互作的轉錄因子是什么?GA2ox基因啟動子序列的保守性與特異性在進化選擇上具體起什么作用?這些問題都是目前研究的關鍵，有關GA2ox基因啟動子響應逆境脅迫的許多問題還需要繼續探索。

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