利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術檢測痰標本中結核分枝桿菌及其耐藥性的研究

張治國 歐喜超 孫倩 杜春英 高鐵杰 趙雁林

我國是全球結核病高負擔國家之一，結核病患者數居世界第二位［1］。目前我國常規應用的結核病實驗室診斷方法如涂片顯微鏡檢查敏感度較低，雖然固體培養具有較高的敏感度但是至少需要3～8周的時間，耗時較長［2］。用于檢測Mtb的核酸擴增實驗在速度上較傳統培養方法具有明顯的優勢，但目前商品化的核酸擴增檢測流程比較復雜，需要高精度設備、強大的技術支持和訓練有素的工作人員，不太適合在大多數資源有限的結核病高負擔國家應用。

利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（Xpert Mtb／RIF）整合了基于定量PCR分子遺傳檢測所需的3個步驟（樣品準備、擴增、檢測），將待檢樣品放入到Xpert Mtb／RIF反應盒中，系統就會自動按照相應的程序運行，實時監測PCR運行情況，一旦PCR完成，Xpert Mtb／RIF檢測系統全自動化的軟件就會判斷出患者是否患有結核病，以及是否對利福平耐藥［3］。本研究通過用該方法檢測588例結核病患者痰標本，研究該技術診斷結核分枝桿菌（Xpert Mtb）及利福平耐藥（Xpert RIF）的敏感度和特異度，探討其在基層實驗室的應用前景。

資料和方法

一、實驗材料

試劑：Xpert Mtb／RIF Kit（Cepheid，USA），SR（sample reagent）（Cepheid，USA），分枝桿菌涂片鏡檢染色液和培養基均來自珠海貝索生物技術有限公司。

二、對象和方法

（一）研究對象

自2010年10月至2011年12月，連續納入588例來昌平區結核病防治所就診的具有肺結核可疑癥狀的初診患者，收集患者痰標本分別進行涂片、培養和Xpert Mtb／RIF檢測。其中涂陽338例、涂陰250例。338例涂陽患者中7例Xpert Mtb檢測結果為錯誤，6例無效，3例Xpert RIF結果為無法判斷；250例涂陰患者中9例Xpert Mtb結果為錯誤，34例無效，2例Xpert RIF結果為無法判斷。最終可進行Xpert Mtb比對分析的患者為527例；527例患者中痰培養陽性363例，17例無Xpert RIF結果，最終可進行Xpert RIF比對分析的患者為346例。

（二）研究方法

對所有入選標本同時做涂片、羅氏固體培養、比例法藥敏試驗和Xpert Mtb／RIF檢測。

1．痰涂片檢查：痰涂片檢查遵照文獻［4］中的標準化操作程序執行。

2．分離培養：吸取2ml痰標本至帶螺旋蓋的前處理管中，視樣本性狀，加入1～2倍體積4%氫氧化鈉前處理液，置渦旋振蕩器上振蕩30～60s至標本充分混勻，室溫放置15min。前處理完成后，以無菌吸管吸取前處理液0．1ml，均勻接種在2支酸性羅氏培養基斜面上，保持斜面水平向上37℃培養24h后，直立放置37℃繼續培養。接種后第3、7天觀察培養情況，此后每周觀察1次，并在分離培養結果記錄本上記錄生長結果［5］。

3．比例法藥敏：用接種環取一環培養基上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對制成1mg／ml菌懸液，梯度稀釋為10-2mg／ml和10-4mg／ml，接種到含利福平（40μg／ml）的羅氏固體培養基和空白對照管培養基，37℃培養4周，觀察結果［5］。

4．Xpert Mtb／RIF核酸擴增檢測：取1ml痰標本置放到有螺旋蓋的前處理管中，然后加入相當于2倍痰標本體積的SR痰標本處理液，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30s，室溫靜置15min，使痰標本充分液化。打開反應盒，取2ml處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應盒，然后將反應盒放置到檢測模塊，儀器開始進行自動化檢測。反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察測試結果。

三、統計學分析

采用SPSS 13．0對Xpert Mtb／RIF檢測和檢測金標準進行一致性檢驗（Kappa檢驗），Kappa≥0．75認為兩者一致性較好

結 果

一、Xpert Mtb／RIF對痰標本Mtb的檢測

使用Xpert Mtb／RIF檢測527例就診患者是否為結核病患者，其中涂陽322例，涂陰205例。與傳統固體培養試驗結果進行比較，結果見表1。

SPSS 13．0統計結果顯示，以固體培養結果為金標準，Xpert Mtb／RIF檢測涂陽患者Mtb的敏感度為98．1%（309／315）、特異度為14．3%（1／7）；檢測涂陰患者 Mtb的敏感度為75．0%（36／48）、特異度為93．0%（146／157）；全部患者檢測的敏感度為95．0%（345／363）、特異度為89．6%（147／164）。對Xpert Mtb／RIF和固體培養進行Kappa檢驗，K＝0．845，兩者具有較好的一致性。

二、Xpert Mtb／RIF檢測痰標本中Mtb對利福平的耐藥性分析

使用Xpert Mtb／RIF方法檢測346例患者痰標本中的Mtb對利福平的耐藥性，其中涂陽309例，涂陰37例。與比例法藥敏結果進行比較，結果見表2。

SPSS 13．0統計結果顯示，以比例法藥敏結果為金標準，Xpert Mtb／RIF方法檢測涂陽患者利福平耐 藥 的 敏 感 度 為 91．0% （39／43）、特 異 度 為96．6%（257／266）；檢測涂陰患者利福平耐藥的敏感度為66．7%（2／3）、特異度為94．1%（32／34）；全部患者檢測的敏感度為89．1%（41／46）、特異度為96．3%（289／300）。對Xpert Mtb／RIF和比例法藥敏進行Kappa一致性比較，K＝0．810，兩者具有較好的一致性。

表1 Xpert Mtb／RIF檢測Mtb效能分析（以固體培養試驗為金標準）

表2 Xpert Mtb／RIF檢測痰標本中的Mtb對利福平耐藥的結果分析（以比例法藥敏試驗為金標準）

表3 Xpert Mtb／RIF方法及測序聯合檢測痰標本的Mtb及利福平耐藥

三、16例傳統藥敏和Xpert Mtb／RIF檢測結果不一致患者菌株rpoB基因測序

16例不一致患者中，涂陽患者13例，涂陰患者3例，測序結果與傳統藥敏結果一致的有5例，測序結果與Xpert RIF結果一致的有11例，以比例法藥敏和測序結果為判斷標準，Xpert Mtb／RIF方法檢測涂陽患者利福平耐藥的敏感度為93．9%（46／49）、特異度為97．0%（258／266）；檢測涂陰患者利福平耐藥的敏感度為100．0%（2／2）、特異度為94．3%（33／35）；全部患者檢測的敏感度為94．1%（48／51）、特異度為98．6%（291／295）。對兩種方法進行統計學分析，進行kappa一致性比較，K＝0．920，兩種方法具有較好的一致性，結果見表3。

討 論

結核病的早期診斷及其耐藥性的檢測，對于很好地控制耐藥結核病的傳播具有十分重要的意義。隨著分子生物學的發展，近年來涌現出很多方法用于Mtb的鑒定及其耐藥性檢測。GeneXpert核酸擴增檢測系統是將樣品準備、定量PCR擴增和熒光檢測集于一身的核酸擴增檢測分析系統。只需要在獨立的反應孔中加入待檢測的生物樣品，2h內便能快速檢測出患者是否患有結核病，以及是否對利福平耐藥。同時由于使用可以密封的一次性反應盒將樣品準備所需的所有試劑都提前裝入其中，減少了操作過程中污染及環境因素導致的實驗結果不精確的可能性。目前，GeneXpert檢測系統已開始應用于白血病，以及腸病毒和鏈球菌等多種病原微生物的檢測。

一、Xpert Mtb／RIF檢測原理及國外評估結果

本研究使用的Xpert Mtb／RIF核酸檢測方法采用GeneXpert檢測系統，是一種半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術，針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區間（RRDR）設計引物、探針，檢測其是否發生突變，進而用于診斷患者是否感染了Mtb，以及是否對利福平耐藥（rpoB序列存在突變）［6］。Helb等［6］研究結果顯示，Xpert Mtb／RIF在痰標本中的檢測極限為131CFU（菌落形成單位）／ml，靈敏度遠高于涂片檢測。在越南選取的29例涂陽患者采用Xpert Mtb檢測Mtb，敏感度達到100．0%；78例涂陰患者Xpert Mtb檢測敏感度和特異度為71．7%和100．0%。在烏干達選取的84例涂陽患者，Xpert Mtb檢測敏感度和特異度為98．4%和100．0%；以傳統藥敏作為金標準，9例耐藥患者均被Xpert RIF檢測為耐藥，55例敏感患者有1例被檢測為耐藥，通過測序發現該例菌株rpoB基因511位點發生突變，證實為耐藥。2010年，在南美洲、非洲和亞洲的多個國家級結核病實驗室納入1843例患者對Xpert Mtb／RIF檢測結果進行了驗證評估，研究結果表明：該方法檢測Mtb的敏感度和特異度分別為96．0%和98．6%，檢測利福平耐藥的敏感度和特異度為97．6%和98．1%，不一致者經測序更正后，利福平耐藥檢測的敏感度和特異度達到99．1%和100．0%［7］。

二、Xpert Mtb／RIF檢測Mtb效能分析

本研究在區縣級結核病防治機構采用臨床就診的肺結核可疑癥狀患者的痰標本，通過Xpert Mtb／RIF檢測Mtb及其利福平耐藥性，結果顯示，Xpert Mtb／RIF檢測Mtb的敏感度達到95．0%，特異度為89．6%，特異度略低于國外相關報道，可能是由于作為金標準的傳統固體培養試驗本身的敏感度并不是很高所致（國外多以液體培養作為金標準）。35例培養和Xpert Mtb診斷結果不一致患者通過查找相關臨床信息，17例培養陰性而Xpert Mtb檢測為陽性患者中，6例為涂片陽性，并且17例患者臨床診斷結果均為繼發性肺結核，Xpert Mtb診斷與臨床診斷結果一致。18例培養陽性而Xpert Mtb陰性患者中，6例為涂片陽性，考慮這18例患者可能為非結核分枝桿菌感染所致。

三、Xpert Mtb／RIF檢測利福平耐藥效能分析

以比例法藥敏試驗為金標準，Xpert Mtb／RIF檢測Mtb對利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89．1%、96．3%。通過對16例不一致患者菌株進行rpoB耐藥基因核心區間測序，將比例法藥敏試驗和差異菌株測序結果聯合作為金標準，Xpert Mtb／RIF方法檢測利福平耐藥的敏感度為94．1%（48／51）、特異度為98．6%（291／295），此結果與國外報道結果基本一致［7］，Xpert Mtb／RIF檢測可以很好地診斷初診患者是否對利福平耐藥。

總之，Xpert Mtb／RIF是一種可以快速、直接可靠、高特異地檢測出結核病患者及是否對利福平耐藥的新診斷技術。2010年12月，WHO推薦使用該方法對耐多藥可疑者和可疑Mtb與HIV雙重感染患者進行結核病診斷［8］。本研究通過對Xpert Mtb／RIF進行臨床應用評估，證明該方法在我國基層實驗室對于結核病診斷及利福平耐藥患者的篩查方面具有一定的應用前景。

［1］World Health Organization．Global tuberculosis control：surveillance，planning，financing：WHO report 2008．Geneva：World Health Organization，2008．

［2］趙雁林，尚美．我國當前結核病實驗室診斷的現狀．中華檢驗醫學雜志，2007，30（7）：97-98．

［3］Varma-Basil M，El-Hajj H，Colangeli R，et al．Rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from India and Mexico by a molecular beacon assay．J Clin Microbiol，2004，42（12）：5512-5516．

［4］趙雁林，姜廣路．痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊．北京：中國協和醫科大學出版社，2009．

［5］中國防癆協會基礎專業委員會．結核病診斷實驗室檢驗規程．北京：中國教育文化出版社，2006．

［6］Helb D，Jones M，Story E，et al．Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand，near-patient technology．J Clin Microbiol，2010，48（1）：229-237．

［7］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al．Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance．N Engl J Med，2010，363（9）：1005-1015．

［8］World Health Organization．Roadmap for rolling out Xpert Mtb／RIF for rapid diagonisis of TB and MDR-TB．Geneva：World Health Organization，2010．