安徽省391株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株MLVA基因分型研究

王慶 董海燕 包訓(xùn)迪 趙秀芹 徐東芳 萬康林

結(jié)核病是當(dāng)今全球范圍對人類最具威脅的傳染性疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示，全球結(jié)核病發(fā)病率以每年1%的比率上升，約每年新增患者880萬［1］。現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)的結(jié)核流行病學(xué)相結(jié)合，形成新的結(jié)核分子流行病學(xué)。多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA）就是該學(xué)科的一個較典型的范例［2］。MLVA是一種以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的方法，其操作簡單、分辨率高、結(jié)果分析容易，具有很高的可重復(fù)性，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間具有非常好的可比性，并能提供數(shù)字化的分型信息，適宜進(jìn)行大量樣本和網(wǎng)絡(luò)化分析［3］。本研究選取391株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，采用Supply等［4］新推薦的MLVA（15位點(diǎn)）進(jìn)行基因分型，以初步了解安徽部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型分布及其流行情況，探討其在今后結(jié)核病控制中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、材料

391株結(jié)核病臨床分離菌株來自于安徽省胸科醫(yī)院2011年1—6月的臨床痰標(biāo)本，所有菌株鑒定為結(jié)核分枝桿菌，-80℃菌株庫保存，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供，作為本實(shí)驗(yàn)的對照菌株。

二、方法

1．結(jié)核分枝桿菌DNA模板的制備：將結(jié)核分枝桿菌臨床分離株常規(guī)接種于L-J培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4～8周，至有菌落生長后，取一接種環(huán)的菌于400μl TE緩沖液（pH 8．3）中懸菌，100℃煮沸15min，13 059×g離心5min后，上清液備用。

2．PCR擴(kuò)增：采用25μl PCR反應(yīng)體系，其中包括2μl模板 DNA、1．5mmol MgCl2，0．2mmol dNTP、上下游引物共30pmol和1．5UTaq DNA酶。分別用15對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃10min；循環(huán)94℃1min，62℃1min，72℃15min，共40個循環(huán)；最后延伸72℃10min。15個位點(diǎn)及引物序列參照文獻(xiàn)［5］，引物由上海生物工程有限公司合成，詳見表1。

3．結(jié)果檢測：2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，GoldViewTM核酸染料染色，用100bp PCR Marker來確定相對分子質(zhì)量的大小，以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv作為對照，計(jì)算出不同結(jié)核分枝桿菌各個可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeats，VNTR）位點(diǎn)的相對分子質(zhì)量和重復(fù)次數(shù)。

4．結(jié)果分析：先用Gel-Pro analyzer 3．1軟件對凝膠進(jìn)行數(shù)字化處理，將指紋圖譜數(shù)字化后，再用BioNumerics（Version5．0）數(shù)據(jù)庫軟件進(jìn)行聚類分析，將實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行分型處理。

5．計(jì)算 Hunter-Gaston分辨率指數(shù)（Hunter-Gaston index，HGI）：計(jì)算各位點(diǎn)等位基因多樣性（h）以及不同VNTR位點(diǎn)組合的HGI，公式如下［6］：

xi為第i等位基因在某個VNTR位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率，N為實(shí)驗(yàn)菌株總數(shù)。

N為菌株總數(shù)，S是所用分型方法劃分的總類型數(shù)，nj是屬于第j類型的菌株數(shù)。

6．計(jì)算菌株成簇率：實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全相同的菌株定義為一簇，成簇率為成簇菌株占總試驗(yàn)菌株的百分率。

表1 VNTR位點(diǎn)、重復(fù)片段大小及其在H37Rv中的重復(fù)次數(shù)

續(xù)表1

結(jié) 果

一、檢測標(biāo)本結(jié)果的重復(fù)性

陽性對照菌株DNA在同一VNTR位點(diǎn)的擴(kuò)增片段大小相同。從檢測標(biāo)本中抽取40株菌株，每株不同VNTR位點(diǎn)重復(fù)檢測3次，每次DNA擴(kuò)增片段大小完全相符。

二、MLVA多態(tài)性檢測

本次共選取了15個特異性較好的VNTR位點(diǎn)來進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示安徽省結(jié)核分枝桿菌的DNA指紋圖譜呈現(xiàn)明顯的多態(tài)性（圖1～4），不同位點(diǎn)的多態(tài)性即h具有較大差異，其中Mtub21位點(diǎn)顯示多態(tài)性最高（h為0．591），其次，MIRU26位點(diǎn)h為0．527；ETR-B、ETR-C、ETR-D和 MIRU23顯示較低多態(tài)性，h 分別為0．125、0．08、0．124和0．137，詳見表2。VNTR-15位點(diǎn) HGI為0．913。

圖1 不同菌株在Mtub21位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳圖

二、MLVA分型

表2 391株結(jié)核分枝桿菌15個MLVA位點(diǎn)重復(fù)單位多態(tài)性分布

表3 391株結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性和VNTR特征分布關(guān)系

1．MLVA分型：經(jīng)BioNumerics 5．0軟件聚類分析，391株分為4個基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），其中Ⅰ群占3．32%（13／391），Ⅱ群占3．07%（12／391），Ⅲ群所占比例最大，為89．00%（348／391），含140個基因型，Ⅳ群占4．60%（18／391）；391株菌共含183個基因型，呈明顯多態(tài)性，其中149株為獨(dú)特類型，余242株分為34簇，成簇率61．89%（242／391），簇的范圍為2～64，最大的一簇包含64株（基因型為424343357333544），占所有菌株的16．4%（64／391）。

2．基因型與耐藥性的相關(guān)性分析：表3結(jié)果顯示，391株結(jié)核分枝桿菌耐藥率占25．06%（98／391），Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群耐藥率分別為30．77%、25．00%、24．71%和27．78%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，基因群分布與藥敏間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0．05）。其中Ⅲ型348株中，利福平耐藥率占19．54%（68／348），異煙肼耐藥率占17．53%（61／348），同時耐異煙肼與利福平（MDR-TB）的有45株，占12．93%（45／348）。

討 論

自1998年Frothingham和Meeker-O’Connell首次使用了11個VNTR位點(diǎn)進(jìn)行基因分型后，近年來許多國家都開展了對這種分型方法的研究，出現(xiàn)了許多種位點(diǎn)的組合方式。Mtb基因組中包含許多類似真核細(xì)胞中小衛(wèi)星序列的散在重復(fù)單元（mycobacterial interspersed repetitive unit，MIRU），H37Rv全基因組序列測定結(jié)果顯示：Mtb基因組中存在41個散在分布的MIRU位點(diǎn)，VNTR位點(diǎn)在Mtb中的分布表現(xiàn)為高度的個體特異性。每個特定的VNTR位點(diǎn)由兩部分組成，包括中間的核心區(qū)和外圍的側(cè)翼區(qū)。核心區(qū)是由含有至少1個的40～100bp的重復(fù)單元組成。一般該重復(fù)單元的堿基對數(shù)目不變，而串聯(lián)在一起的重復(fù)單元的數(shù)目是可變的；外圍的側(cè)翼序列具有高度的保守性［7］。

本研究的患者均來源于安徽省法定專業(yè)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)（安徽省結(jié)核病研究所和安徽省胸科醫(yī)院），連續(xù)收集391例痰培養(yǎng)陽性的結(jié)核病患者，初步反映了安徽省部分地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分布情況。VNTR位點(diǎn)的等位基因多態(tài)性是用于評價(jià)各位點(diǎn)對不同菌株的分型能力的指標(biāo)，就每一個位點(diǎn)而言，它表現(xiàn)為不同菌株在該位點(diǎn)重復(fù)序列拷貝數(shù)的不同。Hawkey等［8］根據(jù)不同位點(diǎn)的等位基因多樣性的不同，將其分為3個等級：高分辨能力（h＞0．6），中等分辨能力（0．3≤h≤0．6）和低分辨能力（h＜0．3）。筆者研究發(fā)現(xiàn)VNTR-15位點(diǎn)的總體分辨率是0．913，不同位點(diǎn)之間的多態(tài)性差異很大。其中Mtub21、MIRU26具有較高的分辨能力，ETR-E、MIRU10、MIRU40和 Mtub39分辨能力一般，而ETR-B、ETR-C、ETR-D和MIRU23的分辨能力較差。在本研究中其余位點(diǎn)的分辨能力也較差，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果并不完全一致［9-11］，可能原因有兩點(diǎn)：（1）安徽具有某一主要流行菌株，即菌株本身的同源性較高，這對位點(diǎn)分型能力的評估造成了一定程度的影響；（2）本研究中所選擇的15個位點(diǎn)尚不足以將所有不同的菌株區(qū)分開，提示還應(yīng)篩選更多的多態(tài)性較好的位點(diǎn)組合起來用以區(qū)分菌株、提高其分型能力。

391株結(jié)核分枝桿菌通過MLVA分型，可分為4個基因群 （Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），以Ⅲ群為優(yōu)勢流行菌型，共183個基因型，34個簇，成簇率為61．89%（242／391），最 大 簇 為 64 株 （基 因 型 為424343357333544），說明這34例患者中的每一例患者至少與另外一例患者具有完全相同的基因型，體現(xiàn)了高的成簇率，提示了高度近期傳播的可能性。另一方面，可能是筆者采用的分型方法其分辨率不足，未能將有區(qū)別的菌株區(qū)分開，以致于出現(xiàn)了不精細(xì)的成簇，這就需要對更多的位點(diǎn)進(jìn)行篩選尋找一種最優(yōu)的位點(diǎn)組合，使得分型結(jié)果更趨于真實(shí)，最大限度地提高其分型能力。但該結(jié)果仍提示應(yīng)加強(qiáng)對安徽地區(qū)主要流行菌株的控制，加速發(fā)現(xiàn)傳染源，及時切斷傳播途徑，增強(qiáng)易感人群的抵抗力和身體素質(zhì)，在最大程度上減少傳播的發(fā)生。如應(yīng)加強(qiáng)基層單位防治結(jié)核的分子流行病學(xué)手段，增加特異性位點(diǎn)，對于菌株成簇情況的判定還可能進(jìn)一步精確，更真實(shí)的反映出Mtb的近期傳播情況，有利于指導(dǎo)傳染源的追蹤。本次分析的391株Mtb耐藥率占25．06%（98／391），經(jīng)卡方檢驗(yàn)，基因群分布與藥敏間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。通過對Ⅲ型菌株的耐藥性比較，發(fā)現(xiàn)68株對利福平有耐藥性，占19．54%（68／348），提示安徽省耐藥菌株的監(jiān)測應(yīng)重點(diǎn)注意耐利福平菌株的流行趨勢。

［1］王慶，楊華，金瑞良，等．結(jié)核分枝桿菌重組蛋白Rv0222的表達(dá)及血清學(xué)鑒定．中國防癆雜志，2012，34（1）：36-39．

［2］Malakmadze N，González IM，Oemig T，et al．Unsuspected recent transmission of tuberculosis among high-risk groups：implications of universal tuberculosis genotyping in its detection．Clin Infect Dis，2005，40（3）：366-373．

［3］ Alonso-Rodríguez N，Martínez-Lirola M，Herránz M，et al．Evaluation of the new advanced 15-loci MIRU-VNTR genotyping tool in Mycobacterium tuberculosis molecular epidemiology studies．BMC Microbiol，2008，8：34．

［4］Supply P，Allix C，Lesjean S，et al．Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，2006，44（12）：4498-4510．

［5］王曉萌，呂冰，柳正衛(wèi)，等．Spoligotyping和 MLVA用于71株浙江省結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因分型的初步研究．中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24（12）：1090-1094．

［6］Kam KM，Yip CW，Tse LW，et al．Opitimization of variable number tandem repeat typing set for differentiating Mycobacterium tuberculosis strains in the Beijing family．FEMS Microbiol Lett，2006，256（2）：258-265．

［7］Mokrousov I，Ly HM，Otten T，et al．Origin and primary dispersal of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype：clues from human phylogeogra-phy．Genome Res，2005，15（10）：1357-1364．

［8］Hawkey PM，Smith EG，Evans JT，et al．Mycobacterial interspersed repetitive unit typing of Mycobacterium tuberculosis compared to IS6110-based restriction fragment length polymorphism analysis for investigation of apparently clustered cases of tuberculosis．J Clin Microbiol，2003，41（8）：3514-3520．

［9］Iwamoto T，Yoshida S，Suzuki K，et al．Hypervariable loci that enhance the discriminatory ability of newly proposed 15-1oci and 24-loci variable-number tandem repeat typing method on Mycobacterium tuberculosis strains predominated by the Bejing family．FEMS Microbiol Lett，2007，270（1）：67-74．

［10］Yokoyama E，Kishida K，Uchimura M，et al．Improved differentiation of Mycobacterium tuberculosis strains，including many Beijing genotype strains，using a new combination of variable number of tandem repeats loci．Infect Genet Evol，2007，7（4）：499-508．

［11］鄧云峰，鄭建禮，景輝，等．結(jié)核分枝桿菌傳播的分子流行病學(xué)特征．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（10）：1380-1383．