線粒體乙醛脫氫酶2基因多態性對健康受試者硝酸甘油效應的影響

張怡，趙鵬飛，胡怡，賈秀娟，張仲義，章政

線 粒 體 乙 醛 脫 氫 酶 2(aldehyde dehydrogenase,ALDH2)是硝酸甘油(GTN)的有效代謝物一氧化氮(NO)形成的關鍵酶。自2002年Chen等[1]報道了ALDH2在硝酸甘油的生物活化中起著重要作用，且對ALDH2的抑制可能與引起硝酸甘油的耐藥有關，之后研究者們逐漸意識到ALDH2可能在硝酸甘油發揮療效過程中起著關鍵作用。如果病人基因中攜帶有突變的ALDH2的基因Glu504Lys，可以使硝酸甘油在體內的生物轉化過程受阻，藥物難以有效發揮作用[2]。ALDH2基因多態性到底對硝酸甘油的藥物效應產生了何種影響，目前尚無明確的定論。本試驗選擇450名我院體檢中心健康志愿者，測定其舌下含服0.5 mg硝酸甘油前后不同時間點的無創血流動力學指標，觀察ALDH2基因多態性對健康受試者硝酸甘油藥物效應的影響。

1 對象與方法

對象：選擇2011-07至2013-03在青島大學醫學院附屬醫院體檢中心查體的膠東半島地區漢族健康志愿者450例，男281例，女169例。年齡范圍25～65歲，平均年齡(48.46±12.83)歲。受試者排除標準：3年內有心腦血管疾病、內分泌疾病、消化系統疾病、腎臟疾病；曾有心肌梗死病史或行心臟手術者；同時服用其他與硝酸酯類作用相似的藥物；臨床診斷肥胖；有酗酒史；參加實驗前化驗有異常；有硝酸甘油服用禁忌癥；高血壓病患者。在入選本實驗研究之前所有志愿者做常規檢驗包括血常規、血凝常規、生化全套、尿常規等。450名健康志愿者的ALDH2基因型，分為野生型(GG）和突變型(GA/AA)，其中，野生型227例，突變型223例。

試驗方案經本院倫理委員會審核批準，所有受試者均自愿簽署知情同意書。

試驗方法：基因型的測定，采集受試血樣2 ml，依地酸（ EDTA）抗凝，使用的血液基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；taqman探針檢測試劑盒購自美國Life Tech公司。

提取DNA：ALDH2基因單核苷酸多態性位點rs671基因型檢測使用美國Life Tech公司taqman探針檢測試劑盒(C__11703892_10)進行分型檢測，檢測流程參照試劑盒使用說明進行；在美國Life Tech公司生產的ABI 9700 PCR儀上開始PCR反應，多聚酶鏈反應（PCR）條件：95℃ 10 min，(92℃ 15 s, 60℃ 1 min) 60個循環，PCR完成后使用美國應用生物系統公司（ABI）7900HT型熒光定量PCR儀進行數據掃描，檢測結果使用相應軟件基因型判讀。(基因型的測定由上海聯合基因公司代測)

無創血流動力學參數的測量（美國Cardio Dynamics公司生產的BioZ.com無創血流動力學檢測儀測定）： 受試者于試驗當日空腹舌下含服硝酸甘油0.5 mg（規格為每片 0.5 mg，批號為 20110311，北京益民藥業有限公司生產），分別在服藥前0 min，服藥后5 min、15 min時測量受試者的無創血流動力學指標。測量時，受試者取平臥位，按照無創血流動力學監測儀(ICG)的操作說明，由專業醫務人員將傳感器置于患者兩側頸根部、劍突水平與腋中線交界的胸部兩側，使接觸部位充分導電，輸入受試者個人信息，包括姓名、性別、年齡、身高、體表面積（BSA）等。待波形穩定后，記錄血流動力學指標心排血量（CO）、血管外周阻力（SVR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），CO取決于心臟前后負荷和心肌收縮力；SVR反應心臟后負荷，反應機體外周血管舒縮狀態。

統計學處理：采用Pearson卡方(χ2)檢驗評價基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)。應用SPSS17.0 統計軟件包進行統計分析, 計量資料采用均數±標準差表示,兩基因型間均數比較采用t檢驗,多時間點間均數比較采用方差分析，基因型內兩兩比較采用SNK-q檢驗，計數資料采Pearson卡方(χ2)檢驗及卡方趨勢檢驗（飲酒比例），以P＜0. 05具有統計學意義。應用多元線性回歸分析多個影響ΔCO、ΔSVR的因素與ALDH2基因多態性之間的線性數量關系。

2 結果

基因多態性的遺傳平衡檢驗：對450位受試者的等位基因、基因型分布進行基因多態性遺傳平衡檢驗，基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律 (χ2= 2.156，P＞0.05)，表明樣本具有群體代表性。

野生型與突變型一般臨床資料的比較：野生型與突變型的樣本數、性別、年齡、吸煙、飲酒比例差異無統計學意義 (P均＞0.05)。表1

表1 患者的一般臨床資料特征

野生型與突變型無創血流動力學參數CO、SVR、心率、收縮壓、舒張壓變化的比較：突變型的CO在服 藥 前 0 min， 服 藥 后 5 min、15 min（CO0min，CO5min，CO15min）三個時間點比較差異有統計學意義

(P=0.025)，其中 CO15min較 CO0min降低顯著 (P=0.008)；

野生型的CO在該三個時間點比較差異有統計學意 義 (P=0.019)， 其 中 CO5min較 CO0min升 高 顯 著(P=0.005)；突變型的SVR在該三個時間點比較差異無統計學意義 (P=0.404)。野生型的SVR在該三個時間點比較差異有統計學意義 (P＜0.001)，SVR5min及SVR15min較 SVR0min均顯著下降，差異有統計學意義(P均＜0.001)。表2

表2 野生型及突變型不同時間點心排血量及血管外周阻力的比較（±s）

表2 野生型及突變型不同時間點心排血量及血管外周阻力的比較（±s）

注：與 CO0 min比 *P＜0.05；與 SVR0 min比△P＜0.05。CO： 心排血量 SVR： 血管外周阻力。余注見表 1

基因型 CO0 min CO5 min CO15 min SVR0 min SVR5 min SVR15 min GA/AA 5.644±1.692 5.333±1.735 5.214±1.729* 1118.909±302.095 1077.81±333.142 1098.76±329.977 GG 5.519±1.152 5.836±1.139* 5.639±1.317 1161.528±282.726 992.096±274.779△ 1091.28±290.670△

突變型的心率、收縮壓、舒張壓在三個時間點比較差異無統計學意義（P=0.126，0.467，0.083）；野生型的心率、收縮壓、舒張壓在三個時間點比較差異無統計學意義（P=0.051，0.139，0.070）。

ALDH2基因多態性與ΔCO、ΔSVR的關系（ΔCO1=CO0min-CO5min，ΔSVR1=SVR0min-SVR5min，ΔCO2=CO0min-CO15min，ΔSVR2=SVR0min-SVR15min）：將ΔCO1作為因變量，將ALDH2基因多態性、性別、年齡、體表面積、吸煙史、飲酒史作為自變量，進行多元線性回歸分析。選擇逐步回歸分析，對方程檢驗，F=168.055，P＜0.001，有統計學意義。對方程中各自變量單獨檢驗，自變量“性別、年齡、體表面積、吸煙史、飲酒史”對因變量的影響不顯著，P值分別為：0.773、0.561、0.949、0.969、0.654，均剔除。僅自變量“ALDH2基因多態性”對因變量的影響顯著，P值為：0.000，回歸方程為：ΔCO1=-0.948+0.631 ALDH2基因多態性。 將 ΔCO2、ΔSVR1、ΔSVR2分別作為因變量，僅自變量“ALDH2基因多態性”對因變量的影響顯著，P值均＜0.001，回歸方程分別為：ΔCO2=-0.670+0.550 ALDH2基因多態性；ΔSVR1=297.774-128.342 ALDH2基因多態性；ΔSVR2=120.351-50.105 ALDH2 基因多態性。

野生型與突變型無創血流動力學參數CO、SVR變化的組間比較：野生型與突變型在ΔCO1比較、ΔSVR1比較有顯著統計學意義(P＜0.001，P＜0.001)；野生型與突變型ΔCO2比較 、ΔSVR2比較亦有顯著統計學意義(P＜0.001，P=0.004)。表3

表3 不同基因型 ΔCO 及 ΔSVR 的比較（±s）

表3 不同基因型 ΔCO 及 ΔSVR 的比較（±s）

注：縮略語注解見表2

GG GA/AA t P ΔCO1 -0.317±0.350 0.311±0.643 12.907 ＜0.001 ΔSVR1 169.432±117.415 41.090±135.001 -10.766 ＜0.001 ΔCO2 -0.119±0.043 0.430±0.046 8.786 ＜0.001 ΔSVR2 70.245±12.769 20.139±11.356 -2.929 0.004

3 討論

硝酸甘油作為抗心絞痛的經典藥物，已有多位學者對其生物轉化機制進行了廣泛研究，2002年Chen等發現在巰基化合物參與下，ALDH2能夠催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亞硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代謝中的重要作用引起越來越多學者的關注。研究發現，ALDH2基因在12號外顯子504位點存在一個點突變，出現堿基置換：G-A，因而 ALDH 2 基因存在 ALDH2* 1、ALDH2*2兩個等位基因，ALDH2*1/ALDH2*1 基因型(野生型)具有ALDH2的正常活力，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突變型雜合型)存在6%的酶活力，而ALDH2* 2/ALDH2*2基因型(突變型純合型)則完全喪失酶的活力[3,4]，這對于40% 的有ALDH2基因變異的亞洲人群具有重要的臨床意義[5]。

基因的多態性與個體間藥物代謝與效應的差異具有相關性。近幾年國外動物實驗研究提示ALDH2基因在硝酸甘油對肺部及循環系統血管床的生物轉化中發揮重要作用[6]，且ALDH2基因的突變可部分減少硝酸甘油的擴血管作用[7,8]。而Isla 等[9]對既往文獻報道的回顧，未發現在ALDH2基因高度突變率的日本人群中存在硝酸甘油的臨床使用障礙，舌下含服硝酸甘油的藥物效應與ALDH2基因多態性的關系臨床證據不足。國內研究ALDH2對硝酸甘油代謝的影響多從基因多態性與冠心病患者心絞痛急性發作時單獨舌下含服硝酸甘油有效與否的角度著手[4,10]，不同研究結果亦有爭議，此外，上述研究中一項重要的衡量指標為疼痛的緩解程度，其界定存在很大的主觀感受性，而影響實驗結果。

本臨床研究應用無創血流動力學檢測儀（ICG）評估硝酸甘油的效應，即監測健康人含服硝酸甘油前后無創血流動力學指標CO及SVR的變化評價硝酸甘油的效應，國內外此類研究不多見，而且本研究使用客觀的數據指標評估硝酸甘油的效應，克服了上述實驗的主觀性，為ALDH2基因多態性影響硝酸甘油的藥物效應提供了臨床證據。ICG是人體阻抗測量技術在心血管血流動力學方面的一個重要應用[11]，根據心臟收縮及舒張時胸腔阻抗的變化,可測得心臟血流動力學狀態[12]，ICG的優勢有無創、安全、經濟、直觀，能幫助代償性與失代償性心衰患者的診斷、評價冠狀動脈病變的嚴重程度[13]、評估藥物治療的效果和長期預后[14]，本研究根據硝酸甘油藥物代謝動力學特點，選取含服硝酸甘油前及服藥后5 min、15 min三個具有代表意義的時間點，結合反應心臟每分輸出量及外周血管阻力的無創血流動力學指標CO、SVR的變化觀察不同基因型受試者含服硝酸甘油的藥效差別。實驗結果如下，含服硝酸甘油后5 min及15 min較含服硝酸甘油前比較：①野生型 CO均上升，突變型CO均下降。②兩種基因型的SVR均下降，野生型下降幅度較大，即ALDH2基因多態性影響反應硝酸甘油效應的CO及SVR的變化。

含服硝酸甘油后 5 min 及 15 min，野生型 CO上升，突變型CO下降的可能解釋：①野生型含服硝酸甘油后HR反射性升高明顯，而每搏輸出量降低相對不明顯，據公式CO=SV×HR，二者乘積增大。②突變型含服硝酸甘油后SV降低明顯而HR升高相對不明顯，二者乘積減小。兩種基因型的SVR均下降，野生型下降幅度較大的可能原因：低濃度的硝酸甘油引起的靜脈舒張遠遠大于小動脈的舒張，繼而左心室舒張末的壓力、外周血管阻力降低，心臟的前后負荷降低，故健康人含服硝酸甘油后外周血管阻力均降低，因野生型具有ALDH2的正常活力，其舒張血管的作用強，所以野生型SVR降低明顯。

本實驗的不足之處：①僅考慮了ALDH2基因多態性對硝酸甘油代謝的影響，而體外及體內研究提示,硝酸甘油的體內生物轉化過程還受以下多種酶的影響，如：谷胱甘肽-S-轉移酶，、細胞色素P450還原酶、黃嘌呤氧化還原酶等在內的數種酶，本研究不能剔除其他酶類對硝酸甘油代謝的影響。②本研究屬于臨床實驗性研究，樣本量尚不足，且限制在健康人群，下一步擬擴大樣本量，納入冠心病患者，進一步觀察ALDH2基因多態性對硝酸甘油效應及治療效果的影響。

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