變性高效液相色譜法檢測晚期肺腺癌人類表皮生長因子受體2突變的探索性研究

趙瑩瑩 盧紹禹 杜文 梁潔 楊艷華

肺癌是全球總體發(fā)病率最高的惡性腫瘤，并且長期為首位的癌癥類致死疾病[1-2]。肺癌根據(jù)病理形態(tài)可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占所有肺癌的85%左右，非小細胞肺癌又可以分為腺癌、鱗癌及大細胞癌。非小細胞肺癌大部分在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)為晚期病例從而失去手術(shù)根治的機會，并且其5年生存率只有15%～16%。隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，肺鱗癌的發(fā)生率有所下降，肺腺癌的比率不斷上升，目前，已成為最常見的肺癌病理亞型。近年來，對于非小細胞肺癌尤其是肺腺癌的遺傳學研究闡明了部分肺癌的發(fā)病機理，即EGFR、KRAS、HER2、ALK等基因突變導致了肺腺癌的發(fā)生并維持其生長[3-7]。針對特定驅(qū)動突變的靶向藥物可以使腫瘤產(chǎn)生明顯的消退，并顯著延長患者無疾病生存期，針對EGFR酪氨酸激酶域突變的小分子抑制劑吉非替尼和厄洛替尼取得了很好的臨床效果[3]。

人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）基因，即c-erbB-2基因，定位于染色體17q12-21.32上。HER2基因異常表達、拷貝數(shù)增加和體細胞突變常見于許多種人類腫瘤，例如乳腺癌中常見到HER2的蛋白高表達和拷貝數(shù)擴增，這部分乳腺癌病例可能從單克隆抗體曲妥珠單抗治療中獲益[8]。前期的研究表明HER2基因構(gòu)成肺腺癌突變譜的一個亞型，約3.8%的肺腺癌有HER2基因酪氨酸激酶域的突變，其中絕大部分為20號外顯子YVMA非移碼插入突變[7-9]。由于晚期肺癌病例往往難以取得足夠的腫瘤組織標本進行基因測序診斷，如何有效地通過其他途徑檢測腫瘤體細胞突變是困擾腫瘤科醫(yī)生的難題。DHPLC技術(shù)是一種高通量篩選基因序列突變的方法，具有快速和高敏感性的優(yōu)點，已經(jīng)證明可以檢測到晚期肺癌患者血清中EGFR基因的突變[10]。本研究旨在探索DHPLC方法檢測晚期肺腺癌患者血清中HER2突變的效果，擴展其應(yīng)用范圍。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)收集本院2006年9月-2010年5月收治的晚期肺癌患者血液樣本，經(jīng)外院已有病理診斷的晚期肺腺癌共52例。其中男31例，女21例，平均年齡（62.09±9.9）歲。其中吸煙者35例，不吸煙者17例；高分化、中分化和低分化肺腺癌分別占13.4%，50.0%和36.6%；Ⅲ期患者7例（13.4%），Ⅳ期患者45例（86.6%）。

1.2 DNA提取 采用QIAmp DNA Blood Mini kit進行血清DNA抽提，操作根據(jù)試劑盒提供的標準步驟。

1.3 PCR擴增 使用HER2基因20號外顯子前后內(nèi)含子引物對外顯子進行PCR擴增，引物為5’-GCCATGGCTGTGGTTTGTGATGG-3’和5’-ATCCTAGCCCCTTGTGGACATAGG-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s循環(huán) 36 次，72 ℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增片段。

1.4 變性高效液相色譜分析 DHPLC檢測使用WAVE4500核酸片段分析系統(tǒng)（Transgenomic公司），試劑主要包括TEAA和乙腈。步驟主要包括：（1）緩慢變性，95 ℃變性5 min，然后以0.03 ℃/s速率緩慢復性至25 ℃，使雜合子形成異源雙鏈；（2）確定熔解溫度，根據(jù)溫度預(yù)測軟件對DNA片段進行序列分析，確定熔解溫度；（3）取10 μl緩慢變性PCR產(chǎn)物上樣，分析流出峰峰形。

1.5 直接測序 對于DHPLC檢測出可疑突變的樣本，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，樣本送商業(yè)測序公司進行檢測。

2 結(jié)果

筆者共對52例收集到的晚期肺腺癌患者血清樣本進行了檢測。通過將野生型對照與檢測樣本1：5制成混合樣本上機檢測，結(jié)果見圖1，共篩選到了3個可疑混合樣本（圖1 c、e、g）。重復進行的PCR直接測序?qū)梢傻臉颖具M行了驗證，證實了混合樣本中各有一個樣本突變（圖1 d、f、h）。HER2基因20號外顯子的突變率為5.7%（3/52），所檢出的突變得到了直接測序驗證，均為YVMA非移碼插入突變，未檢出其他突變類型。

3 討論

非小細胞肺癌尤其是肺腺癌的分子靶向治療目前已經(jīng)成為肺癌研究領(lǐng)域的熱點。以EGFR酪氨酸激酶域小分子靶向抑制劑吉非替尼（易瑞沙）和厄洛替尼（特羅凱）為代表的靶向藥物在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。尤其對于有EGFR酪氨酸激酶域（18-22號外顯子）激活突變的病例，應(yīng)用吉非替尼和厄洛替尼可以產(chǎn)生顯著延長患者的無進展生存期，其總體反應(yīng)率可以達到70%以上。通過對肺腺癌突變譜的研究發(fā)現(xiàn)，除了EGFR之外，還有KRAS、HER2、ALK、ROS1、RET等基因突變或融合導致腫瘤的發(fā)生和進展。其中HER2突變是一種非常有靶向治療前景的亞型。HER2基因的異常常見于很多中人類惡性腫瘤中，包括乳腺癌中的蛋白高表達和基因擴增，結(jié)直腸癌中的蛋白高表達，肺癌中的基因擴增和酪氨酸激酶域激活突變。在HER2基因高表達和基因擴增的病例，HER2單克隆抗體曲妥珠單抗（赫塞丁）治療可以取得較好的效果。前期的研究表明，HER2基因在肺腺癌中突變率為3%～4%，在其他亞型的肺癌中沒有報道，表明HER2突變代表了一個亞型的肺腺癌，有希望從針對HER2的靶向治療中獲益。

在晚期肺癌的基因靶向治療中，另一個影響準確分子分型診斷和治療的因素是往往無法獲得足夠的腫瘤組織標本進行基因診斷。晚期肺癌患者基礎(chǔ)身體條件往往較差，患者及家屬可能不愿接受氣管鏡活檢甚至經(jīng)皮肺穿刺活檢。傳統(tǒng)的活檢一般以明確病理診斷為目的，難以獲取足夠多的組織再次進行基因診斷。因此，探索通過其他標本來檢測肺癌突變具有重要的臨床意義。由于近年來分子生物學實驗儀器的進步，通過外周血液中捕獲腫瘤細胞或腫瘤細胞崩解后釋放的基因片段，進而利用高敏感度的檢測成為了現(xiàn)實。其中DHPLC技術(shù)因其具有高通量和超高敏感度的優(yōu)勢引起了研究人員的注意。在之前的研究中，研究人員已經(jīng)成功利用這一技術(shù)檢測了晚期肺癌患者外周血中EGFR基因的常見突變，并通過與對應(yīng)腫瘤組織的測序研究證實了這一技術(shù)路線的準確性和可行性。在本研究中，筆者使用DHPLC技術(shù)對晚期肺腺癌患者外周血樣本進行了檢測和驗證，共發(fā)現(xiàn)了3例（5.7%）HER2 20號外顯子插入突變，并且得到了直接測序的驗證。直接測序的驗證中兩例突變峰較低（圖1 f、h），這一結(jié)果符合腫瘤細胞DNA含量較低的預(yù)期。

圖1 DHPLC檢測晚期肺腺癌患者血清HER2基因突變片段

總之，筆者的探索性實驗研究表明，在晚期肺腺癌患者外周血液樣本中可以使用DHPLC技術(shù)檢測HER2基因的突變。通過實驗過程中設(shè)置陰性對照和陽性對照進行質(zhì)量控制，這一方法可以準確檢出基因突變，為晚期肺癌患者獲得基因診斷提供了新的檢測方法，使這部分患者有機會接受靶向治療并從中獲益。

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