右美托咪定預處理對大鼠缺血再灌注肝臟TNF-α及ICAM-1表達的影響*

吳文峰 堯永華

在肝臟切除、肝移植等手術或合并肝硬化、失血性休克患者的手術中，肝缺血再灌注損傷是常見并發癥，引起臨床上廣泛關注[1]。肝臟缺血再灌注不但不能使肝組織細胞功能恢復，反而加重了肝臟功能障礙和結構損傷，影響手術的預后。而藥物預處理（pharmacological preconditioning， PPC）操作簡單，只需要使用藥物無需其他特殊儀器設備，安全閾大，近年臨床上常用于肝臟缺血再灌注的研究[2]。Teoh等[3]研究表明，小劑量TNF-α預處理可明顯改善小鼠肝臟缺血再灌注損傷。右美托咪定作為一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，因其具有鎮靜、催眠、抗焦慮、鎮痛及交感神經抑制等作用，近年常用于神經、心臟、腎臟及肺的保護研究。但其對肝臟缺血再灌注的保護作用，目前仍未見有報道。本研究擬通過觀察右美托咪定對大鼠肝臟缺血再灌注后TNF-α和ICAM-1表達水平的影響，了解其減輕肝臟缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠30只，體重150～220 g，年齡8～10周，由中山大學實驗動物中心提供。空調室內飼養，室溫（20±2）℃，相對濕度保持在（55±10）%，自由進食水，術前12 h禁食，但不禁水。隨機分為3組：S組，IR組和Dex組，每組10只。

1.2 實驗處理 假手術組（S組）給予生理鹽水靜滴1 mL/（kg·h）30 min，間隔2 h后僅開腹；肝臟缺血再灌注組（IR組）給予生理鹽水靜滴1 mL/（kg·h）30 min，間隔2 h后行肝臟缺血1 h，再灌注4 h；右美托咪定預處理組（Dex組）給予Dex 5 μg/（kg·h） 30 min，間隔 2 h 后行肝臟缺血 1 h，再灌注4 h。

1.3 肝缺血再灌注模型的建立 腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位固定，腹部脫毛，腹正中線開腹，游離肝臟周圍韌帶，顯露第一肝門，分離肝左葉及中葉的肝動脈、門靜脈、膽管分支，并使用無創血管鉗夾閉行肝臟部分缺血，以防止發生嚴重腸系膜淤血。缺血60 min后恢復再灌注，然后用絲線逐層關腹后置鼠籠中恢復，單籠飼養，禁食但不禁水：維持大鼠肛溫36～37 ℃。

1.4 血清ALT和AST測定 再灌注4 h后處死大鼠，留取腹主動脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，分裝不同的Eppendorf管中，-20 ℃冰箱保存。應用7600型全自動生化分析儀測定ALT和AST活性。

1.5 細胞形態結構檢測 各組于實驗結束后均取下大鼠肝臟，用10%的甲醛溶液固定24 h，75%酒精梯度脫水，然后石蠟包埋，切片做HE染色，用光鏡觀察細胞形態結構變化。

1.6 免疫組織化學法檢測TNF-α、ICAM-1的表達 用免疫組織化學兩步法將防脫石蠟切片染色。TNF-α濃度和ICAM-1濃度均為1：50，用PBS代替一抗作為陰性對照。陽性是細胞膜和胞漿出現棕黃色顆粒。應用CIAS-1000型細胞圖像分析系統，每組隨機選擇5張切片，每張切片隨機選擇5個高倍視野，檢測相應測試區域的平均灰度及其相應面積、陽性反應產物的平均灰度及其相應面積，根據申洪免疫組織化學染色定量方法求得陽性單位（Positive Unit， PU）[4]。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清酶學檢測結果 IR組與Dex組大鼠血清AST、ALT酶水平與S組比較明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；與IR組相比，Dex組ALT、AST酶水平的升高幅度顯著較小，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組ALT、AST含量變化（±s） IU/L

表1 各組ALT、AST含量變化（±s） IU/L

*與S組比較，P<0.01；△與IR組比較，P<0.05

組別 ALT AST S 組（n=10） 45±22 71±18 IR 組（n=10） 2856±842* 3564±789*Dex組（n=10） 2275±673*△ 2986±803*△

2.2 肝組織學變化 S組肝組織結構清楚，無明顯壞死表現；IR組肝小葉結構嚴重破壞，網狀纖維支架塌陷，大片狀肝細胞變性壞死，空泡變性，胞漿疏松化，肝細胞索、肝竇充血腫脹，分界不清，大量炎性細胞浸潤；Dex組肝細胞損傷程度較IR組減輕，肝細胞輕微腫脹，肝小葉結構尚清，肝細胞變性呈小灶狀壞死，有少量炎性細胞浸潤。

2.3 免疫組織化學法檢測 IR組與Dex組大鼠肝組織TNF-α及ICAM-1表達的PU值與S組相比明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）；而Dex組與IR組相比明顯下降，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝組織TNF-α及ICAM-1表達的PU值比較（±s）

表2 各組大鼠肝組織TNF-α及ICAM-1表達的PU值比較（±s）

*與S組比較，P<0.01；△與IR組比較，P<0.05

組別 TNF-α ICAM-1 S 組（n=10） 3.21±0.4512 12.32±1.2676 IR 組（n=10） 18.93±1.2313* 23.02±1.2967*Dex組（n=10） 10.31±1.6213*△ 16.91±1.3431*△

3 討論

有研究表明，肝臟缺血后的再灌注能導致肝組織損傷進一步加重[5]。因此，減輕肝臟缺血再灌注損傷將有助于提高肝移植的成功率。Mustafa等[6]研究表明，右美托咪定能減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。其可能機制：（1）紅細胞變形指數的下降；（2）抑制脂質過氧化物的生成。而TNF-α和ICAM-1在右美托咪定保護大鼠肝臟缺血再灌注損傷機制中的作用，尚未有研究。

過往研究證明，TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，對肝臟缺血再灌注損傷的激發起到十分重要的作用[7]。TNF-α水平與肝臟損傷程度高度相關。肝臟缺血可導致TNF-α水平升高，后者通過活化炎癥細胞，誘導肝細胞凋亡；其介導血栓素、白三烯和前列腺素等多種脂質介質的產生；誘導氧自由基的產生等多種途徑導致肝臟損傷。TNF-α不僅可直接導致肝臟損傷肝竇內皮細胞腫脹，而且能使肝竇內皮細胞表面黏附分子的表達顯著增加。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族的主要代表，介導黏附反應的一個重要黏附分子，廣泛分布于內皮細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞表面。ICAM-1在正常情況下不表達或僅有微量表達，但在內皮細胞損傷時，大量的炎性介質、細胞因子等誘導ICAM-1表達增加[8]。使中性粒細胞與肝竇內皮細胞相互作用的能力增強，導致肝臟微循環障礙。

本實驗通過檢測血清ALT和AST的水平來評價缺血再灌注損傷后肝臟損傷程度的指標。本研究結果顯示，Dex組和IR組大鼠的血清ALT水平明顯高于S組大鼠，而Dex組的升高幅度比IR組小。光學顯微鏡下，S組肝組織無明顯壞死表現，而Dex組肝臟損傷明顯比IR組輕。提示大鼠肝臟在右美托咪定預處理后對缺血再灌注損傷耐受性明顯增強，缺血再灌注造成的肝臟損傷明顯減輕。免疫組織化學結果顯示，S組大鼠肝組織內皮細胞僅有少量的TNF-α及ICAM-1表達；而IR組肝組織血竇內皮細胞著色呈現強陽性，肝組織內ICAM-1和TNF-α的表達明顯增加；Dex組ICAM-1和TNF-α的表達較IR組明顯減少，但與S組比較明顯增加，這與張錦英等[9]的研究結果相一致。肝臟缺血再灌注引起TNF-α的升高。TNF-α不但可直接導致肝臟內皮細胞腫脹損傷，而且能導致ICAM-1表達水平升高。ICAM-1促使中性粒細胞活化以及與在內皮細胞內黏附和聚集?；罨闹行粤＜毎尫诺鞍姿饷负脱踝杂苫M一步加重肝細胞損害。李洋等[10]的研究也證實了這個觀點。ICAM-l通過與其配體LFA-1結合，啟動細胞黏附和活化，使中性粒細胞牢固地黏附于血管壁；ICAM-l還介導中性粒細胞的遷移，使其通過內皮細胞全層至肝實質細胞，釋放出致肝細胞損傷的蛋白酶和反應性氧原子等物質[11]。

綜上所述，肝臟缺血再灌注損傷是包括炎性因子TNF-α激發，ICAM-1過度表達導致中性粒細胞活化及多種信號傳導分子參加的復雜損傷過程。本文中，右美托咪定預處理能減輕肝臟的缺血再灌注損傷，其機制可能與抑制缺血再灌注肝細胞的TNF-α水平，調控ICAM-1表達有關。其具體機制，有待以后進一步研究。

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