低氧預適應對小鼠急性腦梗死缺血半暗帶神經元凋亡的影響及機制研究

趙麗紅， 林立文， 張顏波

低氧預適應(hypoxic preconditioning，HP)是一種機體內源性保護機制，其通過一系列復雜環節調動機體潛能減輕缺氧損傷，對機體起保護作用。腦梗死是神經系統的常見病和多發病，容易造成智能障礙和肢體殘疾等癥狀，但缺乏特異性臨床治療方法或藥物。如何將HP保護理論應用于臨床疾病的治療是目前國內外轉化醫學研究的熱點和難點。我們既往實驗已經初步證實，低氧預適應能改善急性腦梗死小鼠神經功能評分，減少急性腦梗死面積［1～10］。急性腦梗死缺血半暗帶神經元功能的恢復，是提高患者預后的關鍵。Bcl-2、Bax和Caspase-3是神經元凋亡重要調節因子，故本實驗擬觀察低氧預適應對急性腦梗死小鼠缺血半暗帶神經元凋亡的影響，應用激光共聚焦、免疫熒光等實驗技術，檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3等凋亡因子，探索相關機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 立體定位儀(51600型，美國 Stoelting公司)、冰凍切片機(LEICA CM1900型，瑞士徠卡公司)、激光共聚焦顯微鏡(Radiance 2100型，美國 Bio-Red公司)、恒溫培育箱(WGP-350，上海安亭科學儀器廠)、原位細胞凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)、PBS(武漢博士德公司)、SABC-FITC免疫熒光檢測試劑盒(武漢博士德公司)、兔抗鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3抗體、羊抗兔多克隆二抗(SANTA CRUZ公司)、玫瑰紅(美國Sigma公司)、冷光源 (LG-150型，徐州恒達光學電子儀器有限公司)、0.01mol/L PBS、多聚甲醛(SANTA CRUZ公司)。

1.2 實驗動物 清潔級Balb/c近交系小鼠48只，6～8周齡，體質量18～22g，雌雄不拘，由首都醫科大學動物部提供。數字隨機表法分為4組:(1)正常對照組(N)，無任何處理;(2)假手術組(C)，僅行冷光源照射，不注射玫瑰紅;(3)急性腦梗死組(CI)，光化學法誘導小鼠腦皮質梗死模型;(4)低氧預適應+急性腦梗死組(HP+CI)，低氧預適應后復制光化學法誘導小鼠腦皮質梗死模型，每組小鼠12只，共48只。

1.3 低氧預適應模型的復制［1～10］將低氧對照組、低氧預適應組小鼠放入一個125ml的廣口瓶內，立即用橡皮塞封緊，以動物出現第1次喘呼吸為低氧耐受極限的標志，完成低氧暴露1次(H1);隨即再將低氧預適應組小鼠移入新的廣口瓶內、封閉，依此再重復操作3次(H4)，復制低氧預適應模型。正常對照組小鼠不進行低氧暴露。

1.4 光化學誘導小鼠腦皮質急性腦梗死模型的制作［4］室溫 25℃條件下，腹腔注射水合氯醛0.35g/kg麻醉，經尾靜脈緩慢注入100mg/kg的5%玫瑰紅，立體定位儀固定小鼠頭部，沿頭正中切口分離、暴露左側顱骨。以矢狀縫左側2mm、冠狀縫后2mm為中心、直徑3mm為照射野，使冷光源(150W、24V金屬鹵化燈為發光光源，光導纖維傳送，濾去全部紫外線與紅外線，投射出單一綠色光束，波長為530nm)光導纖維探頭垂直貼近暴露的顱骨。注射玫瑰紅后5min時打開冷光源，光照強度2Lx，照射10min后結束縫合頭部皮膚，局部碘酒消毒。假手術組僅照射冷光源，未注射玫瑰紅。

1.5 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法，在腦梗死模型復制后24h處死動物，取出腦梗死缺血半暗帶腦組織，液氮速凍，行冰凍切片，片厚度約10μm;用新鮮配制的4%多聚甲醛溶液固定，室溫30min;PBS洗片，滴加阻斷劑(0.3%H2O2甲醇溶液)，室溫孵育30min;PBS洗片，滴加通透液(0.1%Triton X-100溶于0.1%枸櫞酸溶液)，冰浴中孵育2min;PBS洗2遍，擦干樣品周圍液體，滴加50μl TUNEL反應混合物，37℃濕盒中孵育60min;PBS洗片3次，1:1的甘油PBS溶液封片。應用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統的Ar單通道激光系統，掃描陽性反應物。掃描選用的參數為:激發光波長為488nm，觀測光為518nm，物鏡為40倍，掃描方式為點掃描，Zoom為1.0。經Lasersharp 2000軟件攝像，每只動物分別隨機觀察并計數30個不同視野TUNEL陽性細胞數目，并計算平均值用于分析。

1.6 Bcl-2、Bax和 Caspase-3 FITC 免疫熒光檢測 在腦梗死模型復制后24h死動物，取出腦梗死缺血半暗帶腦組織，液氮速凍，行冰凍切片，片厚度約10μm。4%多聚甲醛固定30min，0.01mol/L PBS沖洗3次。滴加0.01mol/L PBS 1:10稀釋的正常血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體。滴加0.01mol/L PBS 1:200稀釋的兔抗鼠 Bcl-2、Bax和Caspase-3抗體，4℃過夜，0.01mol/L PBS 沖洗3 次。滴加0.01mol/L PBS 1:100稀釋的羊抗兔多克隆抗體，37℃ 孵育 30min，0.01mol/L PBS沖洗 3次。滴加0.01mol/L PBS 1:100稀釋的 SABC-FITC，37℃孵育30min，0.01mol/L PBS沖洗4次。然后滴加0.01mol/L PBS1:1稀釋的甘油封片。應用Bio-Red Radiance 2100型激光掃描共聚焦顯微鏡操作系統的Ar離子激光系統，掃描FITC標記的陽性反應物。掃描選用的參數為:激發光波長為554nm，觀測光為575nm，物鏡為40倍，掃描方式為點掃描，Zoom 為(1.0)。經 Lasersharp 2000 軟件(4.5.3)攝像分析。

1.7 統計學分析 所有熒光圖片經Lasersharp 2000軟件(4.5.3)處理后，每組隨機選取30張行熒光強度和陽性細胞數測定，數據以χ±s表示，由第一、二作者采用SPSS 10.0軟件包中的單因素方差分析(ANOVA)進行統計處理，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 各組神經元凋亡變化 熒光強度檢測結果顯示，TUNEL陽性細胞以綠色熒光表示。N組、C組切片偶見TUNEL陽性(綠色熒光)細胞，CI組、HP+CI組陽性細胞明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0.01);HP+CI組與CI組相比，TUNEL染色陽性細胞明顯減少(P＜0.01)(見圖1、表1)。

2.2 各組Bcl-2表達熒光強度比較 Bcl-2蛋白主要位于神經細胞胞漿、核膜及突起中，在本實驗中標記為綠色熒光。N組、C組切片僅見極少量免疫熒光表達，CI組可見Bcl-2免疫熒光強度增加，HP+CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bcl-2免疫熒光強度明顯增加，有統計學意義，P＜0.01(見圖2、表2)。

2.3 各組Bcl-2陽性細胞數比較 Bcl-2陽性細胞以綠色熒光表示，N組、C組切片偶見陽性細胞，CI組可見Bcl-2陽性細胞數增加，HP+CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bcl-2陽性細胞數明顯增多，有統計學意義，P＜0.01(見圖2、表2)。

2.4 各組Bax表達熒光強度比較 Bax蛋白主要表達于神經細胞胞漿、核膜及突起中，在本實驗中標記為綠色熒光。N組、C組僅見少量星點狀熒光，熒光強度極弱，HP+CI組免疫熒光強度增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bax免疫熒光強度明顯減少，有統計學意義，P＜0.01(見圖3、表3)。

2.5 各組Bax陽性細胞數比較 N組、C組切片偶見陽性細胞，HP+CI組可見Bax陽性細胞數增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Bax陽性細胞數明顯減少，有統計學意義，P＜0.01(見圖3、表3)。

2.6 各組Bcl-2/Bax比值比較 各組Bcl-2和Bax陽性細胞數比值發現，N組和C組相比，無明顯差異，P＞0.05;CI組與 N組、C組相比，Bcl-2/Bax比值明顯減少，P＜0.05;HP+CI組與N組、C組相比，Bcl-2/Bax比值明顯增加，P＜0.01;HP+CI組與CI組相比，Bcl-2/Bax比值明顯增加，P ＜0.01(見表4)。

2.7 各組 Caspase-3表達熒光強度比較 N組、C組切片僅見極少量免疫熒光表達，HP+CI組可見Caspase-3免疫熒光強度增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Caspase-3免疫熒光強度明顯減少，有統計學意義，P＜0.01(見圖4、表5)。

2.8 各組Caspase-3陽性細胞數比較 N組、C組切片偶見陽性細胞，HP+CI組可見Caspase-3陽性細胞數增加，CI組明顯增加。HP+CI組與CI組比較，Caspase-3陽性細胞數明顯減少，有統計學意義，P ＜0.01(見圖4、表5)。

表1 各組凋亡神經元比較(χ ± s，n=6)

表2 各組Bcl-2表達熒光強度、陽性細胞數比較(熒光強度，χ ± s，n=6)

表3 各組Bax表達熒光強度、陽性細胞數比較(熒光強度，χ ± s，n=6)

表4 各組Bcl-2/Bax比值比較

表5 各組Caspase-3表達熒光強度、陽性細胞數比較(熒光強度，χ ± s，n=6)

3 討論

本實驗研究低氧預適應對急性腦梗死缺血半暗帶神經元凋亡的影響，既是低氧預適應理論臨床應用研究，又與傳統腦缺血損傷治療方法不同，側重于調動組織細胞的一系列潛在的抗/耐低氧潛能和機制，從而獲得在低氧條件下保持機體組織細胞生命活動的能力。我們實驗室應用行為學、生理學、形態學、神經化學和分子生物學等多學科技術，對低氧預適應的效應與機制進行了一系列系統的研究并已作出了基本的概括［1～10］。隨著對HP發生發展機制的認識，將有助于臨床尋找防治缺血/缺氧性腦損傷的有效手段或藥物靶分子的研發。眾所周之，急性缺血性腦卒中是臨床常見的急重癥之一，死亡率高，致殘危險性大，搶救急性腦梗死致腦缺血性損傷是其治療的關鍵，積極尋找腦缺血性損傷保護方法或藥物是研究的熱點或難點問題［11～17］。我們既往研究發現:低氧預適應腦保護機制應用到腦梗死臨床治療研究中，從腦梗死體積測定、神經功能評定二個方面研究發現，低氧預適應能明顯減少腦梗死面積，神經功能評分明顯增加，所以低氧預適應能減少小鼠急性腦梗死體積、降低神經功能評分，從而發揮腦梗死致缺血性損傷的保護作用［7］，但這種保護作用機制尚不明確。

Bcl-2、Bax和Caspase-3分別是調節細胞凋亡兩個分子家族中重要的成員，特別是在調節腦細胞凋亡中已經得到廣泛證實。在眾多凋亡調節基因中，Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax的作用已得到廣泛證實，被認為是細胞凋亡最后共同通路之一。細胞受到缺血/缺氧損傷時首先啟動Bcl-2基因表達以抑制細胞凋亡，Bcl-2為 Caspase-3上游調控機制，Caspase-3則是引起凋亡的始發因子，Bcl-2的過量表達能有效地抑制Caspase-3的激活和細胞凋亡。正常情況下，Caspase-3以休眠狀態的酶原形式存在于正常細胞中，可經線粒體依賴途徑和細胞表面死亡區包含的受體兩條不同途徑激活，活化后的Caspase-3可以切割許多蛋白質底物，引起“瀑布式”的級聯反應，最終引起細胞凋亡［5，6］。

本實驗發現，HP+CI組Bcl-2表達既顯著高于CI組;相反 Bax、Caspase-3表達低于 CI組，說明低氧預適應既能增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達又能抑制凋亡促進因子Bax、Caspase-3的表達，維持線粒體結構和功能穩定性，提高神經元缺氧耐受性，抑制細胞凋亡的啟動和凋亡進程的發展，從而抑制急性腦梗死缺血半暗帶神經元細胞的凋亡，維持神經元結構，提高細胞的耐缺氧能力，這為我們之前HP研究中觀察到的HP能減少缺氧后細胞凋亡和壞死形態學改變，減輕動物整體缺氧缺血后神經功能損傷提供了證據［1～10］。低氧預適應理論應用是目前研究的熱點和難點，低氧預適應理論在急性腦梗死中作用已有初步研究，相關機制也在探討中。本實驗從細胞凋亡及其機制方面進行研究，李俊發等也研究發現，應用小鼠整體低氧預適應和大腦中動脈組塞(MCAO)實驗模型，研究低氧預適應對MCAO所致缺血性損傷的影響，從新奇型蛋白激酶C(nPKC)膜轉位的變化、腦衰蛋白反應調節蛋白-2(CRMP-2)磷酸化水平、絲裂原和應激激活蛋白激酶1(MSK-1)及cAMP反應元件結合蛋白(CREB)磷酸化水平等方面，探討相應保護機制［18～20］。研究發現:HP可在一定程度上緩解MCAO小鼠的行為學改變，減少梗死區梗死面積、缺血區吸光度值和水腫率;進一步機制研究發現，HP能緩解梗死區nPKC膜轉位水平的降低;緩解小鼠腦缺血皮質缺血核心區內CRMP-2磷酸化水平的降低和減少皮質缺血半影區內CRMP-2水解片段;提高缺血半影區內MSK-1及其底物CREB的磷酸化水平，參與MCAO腦損傷腦保護機制。與本實驗相比較，都明確肯定HP對急性腦梗死腦損傷的保護作用，不同之處在于從不同機制方面進行研究。總之，低氧預適應對急性腦梗死缺血半暗帶神經元具有抗凋亡作用，與增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達又能抑制凋亡促進因子Bax、Caspase-3的表達機制有關。

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圖1 各組凋亡細胞免疫熒光染色(×40)

圖2 各組缺血半暗帶神經元Bcl-2 FITC染色(×40)

圖3 各組缺血半暗帶神經元Bax FITC染色(×40)

圖4 各組缺血半暗帶神經元Caspase-3 FITC染色(×40)

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