循環MicroRNA:急性心肌梗死的新型標志物

閆 琦， 王文強， 侯 敢， 黃迪南

(廣東醫學院生物化學與分子生物學教研室，廣東湛江524023)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于冠狀動脈粥樣斑塊破裂，冠狀動脈急性閉塞導致血流中斷，心肌嚴重持久缺血、缺氧而致壞死。世界衛生組織預測到2020年冠心病將成為人類的第一大殺手。快速、準確地診斷急性心肌梗死并予以及時、有效的治療對預后至關重要。心肌梗死標志物在AMI診斷中扮演著重要角色，檢測方便、快速、準確率高有著其他檢測手段不可替代的優勢。

一、目前臨床應用的AMI標志物

心肌肌鈣蛋白(cTn，包括cTnI、cTnT)是主要在心臟表達的結構蛋白，目前臨床用其與心電圖和肌酸激酶同工酶(CK-MB)相結合來確診AMI。研究顯示 cTn是目前最好的心肌梗死標志物［1-2］，在胸痛發生的4～12 h即可以在血清中檢測到，并且和心肌梗死面積直接相關。但是cTn在心肌損傷后緩慢的釋放入血液，在AMI發病的前幾個小時仍不夠敏感，并且需要每6 h檢測1次。因此，還需要更早、更高敏感性和特異性的標志物。最近研究顯示高靈敏度肌鈣蛋白檢測方法(hs-cTn)可以早期區分AMI和其他非冠狀動脈心臟病，并具有杰出的精確度［3］，是未來AMI標志物的發展方向之一。

二、microRNA(簡稱miRNA)概述

近年來，miRNA作為新型腫瘤標志物得到了廣泛關注［4］。研究發現一些心臟特異的miRNAs在AMI發生后出現在外周血中，也有可能成為新一代的心肌梗死標志物。miRNAs是真核生物細胞中的一類不編碼蛋白的小分子RNA，平均長約22個核苷酸，具有高度的保守性、時序性和組織特異性。2012年8月1日，miRBase升級至19.0版(http://www.mirbase.org/)，人類 miRNAs共2 042種，其中大部分在細胞生長和凋亡、血細胞分化、同源異形盒基因調節、神經元的極性、胰島素分泌、大腦形態形成、心臟發生、胚胎后期發育等過程中發揮重要作用。心臟中存在200多種miRNA，心肌中最豐富的有miR-1、let-7、miR-133、miR-126-3p、miR-30c 和miR-26a，動脈平滑肌細胞中有miR-145、let-7、miR-125a、miR-125b、miR-23和miR-143。在維持心臟正常功能中也發揮了重要作用，其表達失控和心臟疾病直接相關。

近年研究發現在人體多種體液中也存在著miRNA［5］。血液中有大量的RNA酶，但miRNAs在血漿或血清中卻非常穩定地存在，他們被有效保護以避免接觸RNase，在嚴酷環境的條件下仍能保持穩定。Valadi等［6］報道外切酶體中含有miRNA，血清中的miRNAs是受到外切酶體的保護才免于被消化。然而，關于miRNA是怎樣被外切酶體包裹及哪些因素引起釋放，這些過程中miRNA的功能是否發生變化等問題，還沒有合理的解釋。Mitchell等［7］將血漿放置在室溫中24 h或經過8次反復凍融對miRNAs的量進行測試，發現影響很小，沒有明顯差異。Chen等［8］發現A549細胞提取物中的大分子RNA，如28S rRNA、GAPDH、18S rRNA、β-actin和U6，能被核糖核酸酶輕易降解，而miRNA能一定程度對抗核糖核酸酶，并且在血清中加入核糖核酸酶也不會造成miRNA的降解。由此證明了血清中miRNA不但可以抵抗酶的消化，而且耐酸耐堿，更不受溫度變化及放置時間的影響，比蛋白更適宜作為標志物。

三、miRNA與AMI的早期診斷

van Rooij等［9］用定量聚合酶鏈反應(PCR)和miRNA芯片檢測大鼠心肌梗死模型梗死心肌邊緣區和遠離區的miRNAs表達情況，發現在心肌梗死后3 d，邊緣區有40個miRNAs發生明顯變化(以2倍為界)，其中17個上調、23個下調，遠離區有22個miRNAs發生明顯變化，其中12個上調、10個下調。在心肌梗死后14 d，邊緣區有69個miRNAs上調。Alessandra等［10］在結扎小鼠冠狀動脈6 h后，發現miR-1和miR-133在結扎部位及其邊緣濃度下降，而在外周血液中升高，預示著這些miRNAs釋放到了血液中。人類心肌梗死發生后外周血miRNAs水平也發生變化。AMI患者血液中相關的miRNAs的變化以及CKMB和cTnI的表達量見表1。

表1 AMI患者血液中miRNAs與其對比標志物的變化

miRNA和傳統蛋白質標志物相比具有以下優勢:結構簡單、具有低復雜性、組織細胞特異性、無后加工修飾、檢測方便等。與現有標志物相比，出現更早，準確率更高。Wang等［13］的研究顯示，在出現癥狀4 h的AMI患者血漿中miR-208的檢出率為100%，而 cTnI的檢出率只有85%。Devaux等［14］比較了510例AMI患者和87名健康人的血清hs-cTnT和miRNA，發現AMI患者血漿miRNA-208b和miR-499極度升高，而在健康人血清中幾乎檢測不到，與hs-cTnT相比，miR-499更能提高AMI診斷的準確率。

1.miR-1 miR-1主要在心肌和骨骼肌中表達，分為miR1-1和miR1-2。miR-1參與心臟發育和肌肉分化。Cheng等［12］在體外通過TritohX-100誘導一個心肌壞死模型，發現壞死心肌中的miR-1能夠釋放到培養基中，并且在24 h內很穩定。繼發現miR-1水平在心肌缺血小鼠模型中異常表達后，Ai等［15］用實時定量RT-PCR對93例AMI患者和66名健康人的血漿miR-1水平進行比較，結果顯示AMI患者血漿miR-1水平明顯升高，并且在2周后恢復正常。Long等［11］用實時逆轉錄(RT)-PCR來檢測AMI患者血漿循環miR-1和miR-126水平，同時用ELISA測定血漿cTnI。結果表明miR-1、miR-126和cTnI的表達水平表現出相同的趨勢，預示著miRNAs有可能為新一代的AMI標志物。

2.miR-208 肌球蛋白基因還編碼miR-208a和miR-208b，Ji等［16］用基因芯片來檢測小鼠組織特異的miRNA，發現miR-208只在心臟中大量表達，具有高度特異性，是最適合作為AMI標志物的miRNA。在小鼠AMI模型中，冠狀動脈結扎后1 h血漿miR-208開始增加，3 h達到基線的1 000倍以上，并在24 h回到基礎水平［13］。miR-208在健康人外周血中檢測不到。Wang等［13］報道miR-1、miR-133a、miR-499 和miR-208a在AMI發生后升高，其中miR-208a表現出了最高的敏感性和特異性。通過對444例AMI患者血漿中miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208a、miR-208b 和miR-499濃度的測定，并用單變量分析和性別-年齡調整分析，發現miR-208水平與AMI死亡率有明顯關系［17］。

3.miR-133 miR-133在平滑肌、骨骼肌和心肌中表達，包括miR-133-a和miR-133-b。miR-133是血管平滑肌表型開關的一個重要調節器，在動脈粥樣硬化進展中起了一定作用。在小鼠模型中，miR-133在心肌梗死發生后1 h開始在外周血中出現，3 h達到峰值，比基線高出了1 000倍［13］。同樣的結果也出現在人類，Wang 等［18］對51例AMI患者和28名健康人血漿的miRNA水平進行分析，結果表明AMI患者血漿中的miR-133是健康對照組的4.4倍。雖然miR-133在骨骼肌中表達豐富，但是急性肢體缺血不會導致外周血miR-133水平的升高，表明損傷后外周血miRNA升高具有組織特異性［19］。

4.miR-499 miR-499在肌肉中特異表達，在肌球蛋白基因調控中起重要作用。雖然miR-499在心肌中表達豐富，但是在缺血心肌中濃度下降，說明其已從壞死組織中釋放到外周血中。在大鼠和小鼠心肌梗死模型中外周血miR-499水平顯著升高。Adachi等［20］對 AMI、不穩定性心絞痛、充血性心力衰竭患者和無心臟疾病對照組的血漿miR-499水平進行了評估，結果顯示miR-499在所有AMI患者血漿中都升高。此外，Corsten等［21］比較了有不同程度心臟損害的患者血漿中心臟相關的miRNAs(miR-1、miR-133a、miR-208b和miR-499)，發現AMI患者血漿中miR-208b和miR-499與對照組相比有顯著升高。關于AMI患者循環miRNAs的研究總結見表2。

表2 AMI患者循環miRNAs的研究總結

四、循環microRNA的檢測方法

目前循環miRNA檢測方法主要有:miRNA芯片、Northern blot、原位雜交技術、熒光實時定量RTPCR(qRT-PCR)和高通量測序(Illumina/Solexa)。大致可分為兩類:一類是單樣本檢測方法，如Northern blot、原位雜交技術、qRT-PCR。另一類是高通量的檢測方法，如高通量測序技術、微陣列芯片技術等能夠同時測定多個樣本，相對于單樣本檢測方法，其能快速大規模地檢測多個microRNA的表達情況，但此方法所需樣本量大，且準確性低，不利于精確定量miRNA。循環miRNA表達與定量檢測最常用的方法是qRT-PCR，此方法特異性和靈敏度高，并且操作相對簡單。大量實驗研究均用此方法進行miRNA的定量檢測。qRT-PCR主要是基于莖-環的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和基于polyA加尾的RT-PCR方法。這2種方法均可以采用Taqman探針或者SYBR熒光染料，前者特異性更高，后者通用性好。Chen等［8］不經過總RNA的提取，直接使用10μL血清進行qRT-PCR分析的結果，與血清提取總RNA后進行qRT-PCR分析的結果一致。這種方法如果能進一步優化將會減少miRNA檢測的步驟及成本。也有研究通過miRNA反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA后進行PCR擴增定量［23］。基因芯片可以同時檢測數百個miRNA。在玻璃載體上固定一系列核苷酸捕獲探針，然后從樣本中抽提總RNA與捕獲探針進行雜交。可通過使用錨定核酸的方法(LNAs)來對探針的退火溫度進行標準化，適用于臨床大規模初步篩查。新一代測序技術在無需任何序列信息的前提下即可進行miRNA表達譜研究，并在此基礎上發現和鑒定新的miRNA分子，但是此方法價格偏高。最近，Lusi等［19］發現用電化學基因傳感器能夠更加簡便快速地檢測循環體液中的miRNAs，而且敏感度可達0.1 pmol/L。miRNA檢測方法的發展進一步為miRNAs成為生物標志物提供了可能。

五、展望

心肌特異的miRNAs:miR-1、miR-133、miR-208和miR-499作為AMI標志物具有在外周血中出現早且穩定、準確率高、結構簡單等優勢。miRNAs和hs-cTn聯合應用于AMI的早期，也許可以提高檢出率和準確率。血清miRNAs也許可以列入60歲以上患者入院常規檢查項目，以篩查不典型AMI，降低死亡率。Matsumoto等［24］的調查研究發現，miRNAs還可以評估預后，AMI康復的患者血清中miR-155和miR-380水平的升高可以預測1年內的心臟性死亡。miRNAs在臨床上的推廣應用之前，還有許多問題需要解決:目前的實驗所用標本量較小，需要進一步大規模實驗證實從AMI發病到miRNAs在外周血中可檢測到的最短時間、在外周血中的參考區間、4組標志物在外周血中出現的順序及聯合檢測的最佳方案等。Widera等［17］的研究發現不穩定性心絞痛和心肌梗死患者血漿中的miRNAs有大量重疊，如何區分心絞痛和心肌梗死需進一步實驗解決。miRNAs新的快速檢測技術的開發也非常重要。qRT-PCR雖然有著卓越的敏感性和特異性，但是仍需要2～3 h的檢測時間，不利于早期快速確診和計算梗死面積。另外，目前仍缺乏一套標準化程序，難以保障結果的穩定性。隨著研究的深入，miRNAs作為AMI早期診斷標志物值得期待。

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