原核表達重組牛凝乳酶原及重組牛凝乳酶酶學特性*

普燕，李軼杰，張富春

(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊，830046)

凝乳酶是制造干酪過程中起凝乳作用的關鍵性酶，對干酪的質構及干酪特有風味的形成有非常重要的作用。它存在于未斷奶的哺乳動物胃中，能夠專一性裂解κ-酪蛋白多肽鏈105～106位的苯丙氨酸和甲硫氨酸之間的肽鍵［1－3］，使得酪蛋白沉淀凝聚，乳清排出。凝乳酶的傳統來源是吃奶的小牛皺胃(第四胃)，可用來制作各種類型的干酪，也是衡量其他凝乳酶代用品的標準。隨著世界范圍內干酪市場需求的日益增長，來源于小牛皺胃的凝乳酶制劑難以滿足干酪制作的需求量，人們開始尋找小牛凝乳酶替代品。凝乳酶按來源分為動物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶以及基因工程凝乳酶。但植物蛋白酶受到時間與地域限制，不能大規模獲得;微生物凝乳酶對蛋白質分解能力比皺胃酶高，干酪得率低，成熟后味苦，耐熱性高，給乳清的利用帶來不便;其他動物來源的凝乳酶雖能替代部分小牛凝乳酶制作干酪，但也存在來源不穩定，酶穩定性差或凝乳活性低等問題。目前仍然認為，小牛凝乳酶是最佳的干酪制作凝乳酶，因此基因工程成為解決凝乳酶制劑需求量的新途徑，目前已成功獲得牛［4－5］、水牛［6］、山羊［7］和單峰駝［8］等多種動物的基因工程重組凝乳酶。研究表明，基因工程凝乳酶與天然小牛皺胃酶幾乎完全相同，酶學特性沒有明顯差異［9］。此外，重組牛凝乳酶產品的純度高，含100%凝乳酶(小牛胃萃取液僅含70% ～90%凝乳酶)［10］，所制造的干酪在收率與品質上也優于小牛胃凝乳酶制造的干酪。

本研究結合乳酸菌和大腸桿菌密碼子的偏愛性合成了凝乳酶原基因，實現了凝乳酶原在大腸桿菌的高效表達。表達產物經包涵體純化后，通過復性處理獲得大量較高純度的重組凝乳酶酶原，對其進行酸化/中和處理，獲得具有活性的凝乳酶，并研究了凝乳酶的酶學特性，旨在為凝乳酶的工業化生產提供高效表達的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒

大腸桿菌E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)、表達載體pET30a、含有牛凝乳酶原序列的質粒pGEX-4T-1-pCHY［11］為本實驗室保存;密碼子優化的牛凝乳酶原序列由上海生工(上海)有限公司合成，序列如下:

GAATTCGCTGAAATCACTCGTATCCCACTTTACAAAGGTAAATCACTTCGTAAAGCTCTTAAAGAACACGGTTTGCTTGAAGACTTCCTTCAAAAACAGCAATACGGTATCTCATCAAAATACTCAGGTTTCGGTGAAGTTGCTTCAGTTCCACTTACTAACTACCTTGATTCACAATACTTCGGTAAAATCTACCTTGGTACTCCACCACAAGAATTTACTGTTCTTTTCGATACTGGTTCATCAGATTTCTGGGTTCCATCAATCTACTGTAAATCAAACGCTTGTAAAAACCACCAACGTTTCGATCCACGTAAATCATCAACTTTCCAAAACCTTGGTAAACCACTTTCAATCCACTACGGTACTGGTTCAATGCAAGGTATCCTTGGTTACGATACTGTTACTGTTTCAAACATCGTTGATATCCAACAAACAGTAGGTTTGAGCACTCAAGAACCAGGTGATGTTTTCACTTACGCT-GAATTTGATGGTATCCTTGGTATGGCTTACCCATCACTTGCTTCAGAATACTCAATCCCAGTTTTCGATAACATGATGAACCGTCACCTTGTTGCGCAGGACTTGTTCAGCGTCTACATGGACCGTAACGGTCAAGAATCAATGCTTACTCTTGGTGCTATCAACCCATCATACTACACTGGTTCACTTCACTGGGTTCCAGTTACTGTTCAACAATACTGGCAATTCACTGTTGATTCAGTTACTATCTCAGGTGTTGTTGTTGCTTGTGAAGGTGGTTGTCAAGCTATCCTTGATACTGGTACTTCAAAACTTGTTGGTCCATCATCAGATATCCTTAACATCCAACAAGCTATCGGTGCTACTCAAAACCAATACGGTGAATTTGATATCGATTGTGATAACCTTTCATACATGCCAACTGTTGTTTTCGAAATCAACGGTAAAATGTACCCACTTACTCCATCAGCTTACACTTCACAAGATCAAGGTTTCTGTACTTCAGGTTTCCAATCAGAAAACCACTCACAAAAATGGATCTTAGGTGATGTTTTCATCCGTGAATACTACTCAGTTTTCGATCGTGCTAACAACCTTGTTGGTCTTGCTAAAGCTATCCTCGAGTAATCTAGA

1.1.2 試劑和培養基

核酸限制性內切酶和DNA Marker，大連寶生物工程有限公司;T4DNA連接酶，北京全式金生物技術有限公司;蛋白Marker，北京康為世紀生物科技有限公司和大連寶生物工程有限公司;膠回收試劑盒，北京天根試劑公司;卡那霉素，上海生工有限公司;商品重組凝乳酶(CHY-MAX○Rpowder Extra NB)，丹麥科漢森公司;其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸桿菌表達載體的構建與鑒定

將 pGEX-4T-1-pCHY［11］和 pET30a 質粒分別用EcoR I和XhoI酶切后，將載體pET30a與基因片段prochymosin連接并轉化E.coliDH5α，提取質粒酶切鑒定后送上海生工公司測序，測序正確的重組質粒命名為pET30a-pCHY，并轉化E.coliBL21(DE3)，獲得重組菌E.coliBL21(pET30a-pCHY)。

1.2.2 重組凝乳酶原基因誘導表達條件的優化

挑取表達重組凝乳酶原的陽性菌落，接種于5 mL新鮮含有卡那霉素(50 mg/L)的LB培養基37℃振蕩培養過夜。次日，按1% 的接種量接至新鮮含有卡那霉素LB培養基中，當OD600達到0.6～0.8時:(1)加入終濃度為 0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導表達4 h，離心收集菌體，用PBS洗滌后進行全菌蛋白SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達情況，得出最優的IPTG添加量;(2)加入終濃度為0.02 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃誘導表達 1、2、3、4、5、6、8、12 h，離心收集菌體，用 PBS洗滌后進行全菌蛋白SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達情況，得出最優的收獲菌體時間。

1.2.3 重組凝乳酶原大量表達與凝乳酶的初步純化

誘導表達1 L菌液，8 000 r/min離心1 min后除去培養基上清液，菌體沉淀用20 mL PBS洗滌3次，加18 mL細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.0)，2 mL 10%Triton X-100，苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為1 mmol/L及添加溶菌酶至終濃度1 mg/mL，冰浴30 min，超聲至菌液不再黏稠。12 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀加20 mL細胞裂解液和2 mL 2%脫氧膽酸，冰浴30 min，期間不斷攪拌。12 000 r/min離心15 min，棄去上清液，重復洗滌3次。加6 mol/L尿素溶解包涵體，12 000 r/min離心去除不溶雜質，將溶液裝入透析袋中，放入約50倍體積的透析液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0)中透析，每12 h換一次尿素含量從高向低逐級遞減的透析液，最后用不含尿素的透析液透析3次，12 000 r/min離心20 min，上清液分裝保存。

將獲得的重組凝乳酶原用1 mol/L HCl調pH到2.0，室溫放置2 h，再用1.5 mol/L Tris回調 pH到6.0。此時出現大量絮狀沉淀，將此液于12 000 r/min離心10 min，上清液中只含有活化的凝乳酶與his標簽融合的酶原N端釋放肽段，此即為初步純化的凝乳酶。商品重組凝乳酶作為對照，用蒸餾水按1∶20(w/v)配制后進行相關測定。

1.2.4 重組凝乳酶活性測定

采用阮小華等［12］方法，略有修改。取 10 mL 10%的脫脂乳(用0.01 mol/L CaCl2配制)，在35℃下保溫5 min，加入0.5 mL初步純化的凝乳酶液，迅速混合均勻，直到在管壁上觀察到凝乳顆粒，準確記錄從加入酶液到乳液凝固的時間(s)，把40 min凝固1 mL 10%的脫脂乳定義為1個索氏單位(soxhlet unit)。

式中:t為乳液凝固時間，s;D為酶液稀釋倍數。

1.2.5 凝乳酶作用最適溫度的測定

采用李玉秋等［13］方法。將酶反應體系在20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47、50、52、55、57、60、62、65、67、70℃下檢測重組凝乳酶的活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度下凝乳酶的相對酶活力，商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復3次。

1.2.6 凝乳酶的熱穩定性

采用李玉秋等［13］的方法，略有改動。將酶液分裝于試管中，分別在 35、40、45、50、55 ℃水浴中溫育，每隔10 min取樣(55℃每隔2 min取樣)，迅速冰浴冷卻。在35℃下測定殘余重組凝乳酶的活力，將未處理酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復3次。

1.2.7 凝乳酶作用的最適pH值

采用阮小華等［12］的方法，略有改動。用濃度為2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH將10%脫脂乳的pH調到 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在 35℃ 水浴中溫育 5 min，進行酶活力的測定，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同pH乳液中凝乳酶的相對酶活力。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復3次。

1.2.8 凝乳酶的pH穩定性

采用阮小華等［12］的方法，略有改動。用濃度為0.2 mol/L的 HCl和0.2 mol/L的NaOH將酶液的pH 調到 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在冰上放置2 h，將酶液pH回調到6.0，測定酶活，比較未處理的酶活力計算相對酶活。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復3次。

1.2.9 金屬離子對酶活的影響

采用Jiang等［5］的方法，略有改動。將酶液中添加 NH4Cl、KCl、NaCl、AlCl3、FeCl3、CaCl2、ZnSO4、MgCl2、CuSO4、NiCl2的水溶液，使金屬離子終濃度達到10 mmol/L，4℃放置2 h測定酶活，比較未處理的酶活力計算相對酶活。商品重組凝乳酶作為對照，實驗重復3次。

1.2.10 蛋白酶抑制劑對酶活力的影響

采用姜媛媛等［14－15］方法，略有改動。將胃蛋白酶抑制劑pepstatin A和苯甲基磺酰氟(PMSF)配制成儲存濃度，按一定量加入酶液中混勻，放37℃下溫育1 h和24 h，同時做空白對照(不加任何蛋白酶抑制劑)。商品酶按1∶10(g∶mL)配制并進行相同處理。在35℃下測定殘余酶活力。將空白對照酶液的酶活力定義為100%，分別計算不同處理條件酶液的相對活力。

2 結果

2.1 表達載體pET30a-pCHY的構建與重組牛凝乳酶原誘導表達條件的優化

表達載體pET30a-pCHY經EcoR I和XhoI酶切鑒定，得到約1.1 kb的片段，與理論值大小相符，測序結果與合成序列完全一致，表明表達載體pET30apCHY構建成功。將重組質粒轉化BL21(DE3)進行重組蛋白表達。通過添加不同的IPTG濃度及在不同的誘導時間取樣，我們觀察到添加IPTG誘導后，在47 kDa左右出現與理論值相符的目的蛋白，即牛凝乳酶原，同時在37℃，220 r/min條件下，最佳的誘導表達條件為:IPTG添加終濃度為0.02 mmol/L，誘導時間為4 h(見圖1)。

圖1 重組蛋白表達條件的優化Fig.1 Optimization of the recombinant protein expression

2.2 重組菌株的誘導表達與初步純化

將轉化pET30a-pCHY重組質粒的E.coliBL21(DE3)按1%接種1 L新鮮卡那霉素抗性的LB培養基，誘導表達重組蛋白。誘導前和誘導后全菌菌體分別留樣，其余培養物離心收集菌體，用PBS洗凈菌體沉淀后超聲裂解至菌液不再黏稠，對菌裂解上清液和菌裂解沉淀、包涵體懸液、尿素溶解包涵體及透析蛋白分別取樣進行SDS-PAGE檢測。如圖2所示，目的蛋白為包涵體形式表達，用凝膠圖像分析軟件band-scan5.0分析，目的蛋白表達量占總菌蛋白的66.3%，包涵體的復性率達83.2%，通過計算，1 L新鮮的LB培養基可以最終獲得目的蛋白約200 mg。

圖2 重組蛋白表達檢測Fig.2 Detection of the recombinant protein expression

2.3 重組牛凝乳酶原活化及凝乳活性檢測

透析復性的重組蛋白經過酸化/中和處理，取處理前和處理后樣品進行SDS-PAGE電泳檢測。由圖3可以看出，與處理前的蛋白相比，經酸化/中和處理后，47 kDa左右處的條帶消失，在37 kDa與10 kDa處出現了新的特征性條帶，其中37 kDa處條帶與理論成熟凝乳酶(36.5 kDa)大小相近，10 kDa與his標簽融合凝乳酶原N端釋放肽段大小相符，表明初步純化出的凝乳酶原保留自剪切功能活性。

圖3 重組牛凝乳酶原的活化Fig.3 Activation of the recombinant bovine prochymosin

繼續進行凝乳酶活性檢測，在10%脫脂乳(含0.01 mol/L CaCl2)中加入活化的重組凝乳酶，乳液凝固，而未加酶的對照脫脂乳不凝，說明重組凝乳酶有凝乳活性。將重組凝乳酶原和凝乳酶分別進行凍干并復水，均保留原有活性，且計算得出凍干凝乳酶活力達到600 000 SU/g。從圖3中觀察到，酸化/中和處理后的凝乳酶液中含有較多的雜蛋白，經過12 000 r/min離心10 min處理，可以得到僅含有凝乳酶和his標簽融合凝乳酶原N端釋放肽段的酶液(第3泳道)，用該方法可初步純化凝乳酶，用于后續酶學特性實驗。

2.4 重組牛凝乳酶酶學特性分析

2.4.1 重組酶的最適作用溫度

從圖4可以看出，原核表達重組凝乳酶與商品凝乳酶反應體系最適凝乳溫度在57～62℃，反應體系高于65℃，凝乳活性迅速下降。

圖4 重組牛凝乳酶的最適作用溫度Fig.4 The optimum activity temperature of the recombinant chymosin

2.4.2 重組酶的最適作用pH值

從圖5可以看出，原核表達重組凝乳酶與商品凝乳酶均隨酶反應體系pH值增高，凝乳活力下降。pH大于8時，凝乳活性完全喪失。

圖5 重組酶的最適作用pHFig.5 The optimum activity pH of the recombinant chymosin

2.4.3 重組酶的熱穩定性

由圖6看出，原核表達重組凝乳酶與商品凝乳酶在35℃和40℃中放置1 h，酶活力保持良好，隨著溫度的增加，酶活力出現明顯的下降趨勢，商品凝乳酶較原核表達重組酶更為明顯。溫度達55℃時，兩者在短時間酶活喪失。

圖6 重組凝乳酶的熱穩定性Fig.6 The thermal stability of the recombinant chymosin

2.4.4 重組酶的pH穩定性

如圖7所示，原核表達重組凝乳酶與商品重組凝乳酶在pH 2～7，酶活穩定，保持在85%以上，當pH值大于7時，酶迅速失活。

圖7 重組凝乳酶的pH穩定性Fig.7 The pH stability of the recombinant chymosin

2.4.5 金屬離子對酶活的影響

從圖8可以看出，Al3+、Fe3+和Cu2+對原核表達酶活力有增強作用，比較未處理組的酶活，相對酶活力達到150%、130%、128%;但這3種離子作用的商品酶活力分別為106%、78%、94%，即除了Al3+對商品酶活力作用為增強之外，Fe3+和Cu2+對其酶活有抑制作用。其次Zn2+對二者的作用也不同，相對酶活分別為105%和93%。其他離子中，Ni2+對兩者酶活均有明顯抑制作用，NH4+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+對酶活作用不明顯。

圖8 金屬離子對酶活的影響Fig.8 The effect of metal ions on enzyme activity

2.4.6 酶活性抑制實驗

利用1 μmol/L和25 μmol/L的 pepstatin A 對酶活進行抑制效果分析(圖9，圖10)。37℃處理1 h，原核表達重組凝乳酶活力下降10%和38%，商品凝乳酶活力下降15%和46%;37℃處理24 h，原核表達重組凝乳酶活力下降26%和53%，商品凝乳酶活力下降32%和44%。在對照實驗中，加入PMSF 1 000 μmol/L和5 000 μmol/L均沒有觀察到對酶活的抑制作用。

圖9 蛋白酶抑制劑對重組凝乳酶的活性抑制作用Fig.9 The inhibition effect of the protease inhibitor on recombinant chymosin activity

圖10 蛋白酶抑制劑對商品凝乳酶的活性抑制作用Fig.10 The inhibition effect of the protease inhibitor on commercial chymosin activity

3 討論

凝乳酶是制作酶凝干酪的關鍵性酶，凝乳酶品質決定了干酪的出品率與質地。傳統來源于小牛皺胃的凝乳酶制劑已經不能滿足日益增長干酪制作的需求，需要尋找小牛凝乳酶的替代品。基因重組凝乳酶因其產量高、來源穩定、品質與天然凝乳酶相同、價格低廉而廣泛用于干酪制作。雖然已經有許多國家用基因工程的方法生產重組凝乳酶并進行干酪制作，但我國凝乳酶制劑主要依賴進口，這對我國的干酪工業發展極為不利。

通過人工合成原核密碼子優化的凝乳酶原基因，在大腸桿菌中獲得大量表達，凝乳酶原經酸化/中和處理，凝乳酶活力達600 000 SU/g。但在酸化/中和處理時，當pH值從2.0回調至6.0時，出現大量沉淀，這與張俊瑞［16］等報道的相同，可能原因是由于在體外復性過程中僅部分凝乳酶原能完成正確折疊進而實現自我催化，而未正確折疊的重組蛋白則在酸化/中和的過程中以沉淀形式析出。大腸桿菌表達系統雖然能高效表達重組蛋白，但多以包涵體形式表達，需要溶解與復性過程，因而很多學者致力于提高包涵體的復性率研究。中國科學院微生物所的楊開宇［17］等人，在其發明專利中采用優化的溶解包涵體及再折疊的工藝，可使復性率達到50%左右。唐兵［18］對蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)與GSH/GSSG促進重組凝乳酶原復性進行了比較，發現二硫鍵的錯誤配對是影響凝乳酶原多肽鏈正確折疊的主要原因。以上兩種提高包涵體復性率的方法中均使用了GSH/GSSG，本研究在包涵體復性過程中運用逐步降低尿素含量的透析方法，讓酶原在緩慢去除尿素的過程中復性，依然得到大量高活性的凝乳酶，為后續凝乳酶的工業化生產提供了一條低成本的純化選擇。

本研究表達的重組凝乳酶最適作用溫度為57～62℃，在pH 2～7、35～40℃范圍內均比較穩定，酶學特性與商品酶完全相同。金屬離子Al3+和Fe3+對酶活有增強作用，與Jiang等［5］人研究結果一致，但是關于Cu2+對酶活的作用效果截然相反。本研究表明Cu2+能夠增強酶活，而在Jiang等人結果中，Cu2+對酶活是抑制作用，同時本研究中Cu2+對商品凝乳酶作用后也表現出酶活力的輕微下降。由于離子對酶的影響比較復雜，差異可能與處理條件、離子濃度與蛋白濃度的比例、表達系統及表達的重組凝乳酶修飾差別有關，具體原因需進一步研究。本研究進行酶學特性實驗的酶液中混合有his標簽融合的酶原釋放肽段，該肽段的存在是否影響了酶活力及金屬離子對酶活的作用也有待進一步探討。抑制劑對原核表達的重組酶影響實驗中，pepstatin A對酶活具有明顯的抑制效果，37℃處理1 h為10%和40%;處理24 h為20%和50%。但抑制效果低于姜媛媛等［14－15］人的結果，推測原因可能是重組凝乳酶的濃度過高，抑制效果不佳。本研究用PMSF作為抑制劑，發現加入PMSF的酶活力比空白對照酶活力還高，可能是因為PMSF抑制了酶液中其它微量的酶，而這些酶可能對于凝乳酶活性有一定影響。總之，原核表達的重組凝乳酶在溫度和pH方面的酶學特性與商品重組凝乳酶相似，同時表達獲得的重組凝乳酶從酶活力和濃度方面有工業化生產的潛力，可為我國實現凝乳酶的工業化生產提供優良的潛在菌種。

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