Plk1磷酸化修飾Tara蛋白對HeLa細胞胞質分裂及增殖的影響*

王 沖, 王偉瓊，余 建，劉延方，孫 玲，孫 慧，黃 河#

1)鄭州大學第一附屬醫院血液科 鄭州 450052 2)浙江大學附屬第一醫院骨髓移植中心 杭州 310003

Tara蛋白作為一個新的F-肌動蛋白結合蛋白，由Seipel等[1]在2001年首先鑒定出來。Tara蛋白含有一個氨基端的PH結構域和一個羧基端的卷曲螺旋結構域，在酵母及脊椎動物中均有廣泛的表達。有研究[2]表明Tara蛋白不但在調控肌動蛋白及細胞骨架蛋白的組合過程中起重要作用，在F-肌動蛋白的形成中也起關鍵作用。作者在前期研究[3]中發現Tara蛋白能夠與E3泛素化連接酶HECTD3結合進而發生泛素化降解，并且HECTD3能夠通過調控Tara蛋白的表達量參與細胞周期的調節，但Tara蛋白參與細胞胞質分裂的具體機制并不清楚。為此，作者進行了如下研究，探討Plk1磷酸化修飾Tara蛋白對HeLa細胞胞質分裂及增殖的影響。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑人胚腎293T細胞株及人宮頸癌HeLa細胞株由浙江大學血液分子生物學實驗室保存，胎牛血清購自Hyclone公司，青、鏈霉素和DMEM培養基購自Invitrogen公司，胰蛋白酶購自華美(SABC)公司，Nocodazole、G418購自Sigma公司。

1.2質粒含有Flag標記的Tara真核表達質粒通過PCR從人睪丸cDNA文庫中擴增獲得；BD-Tara、GFP-Tara、Flag-Tara、GST-Tara質粒均通過PCR擴增Tara片段，于EcoRⅠ或SalⅠ限制性內切酶位點分別插入pGBKT7、pEGFP-C2、p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3質粒構建而成；Flag-Plk1、GST-Plk1質粒通過PCR擴增Plk1片段插入p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3質粒構建而成。所有質粒均經測序證實。

1.3抗體鼠抗GFP單克隆抗體購自Cell Signaling公司，鼠抗Flag單克隆抗體M2、鼠抗α-tubulin單克隆抗體購自Sigma-Aldrich公司，兔抗Tara多克隆抗體由課題組自行免疫兔并純化獲得，鼠抗Plk1單克隆抗體、鼠抗磷酸化絲氨酸單克隆抗體購自Abcam公司，羅丹明偶聯羊抗鼠IgG抗體購自Jackson Immunoresearch公司。

1.4其他材料AH109酵母菌種及BL21大腸桿菌菌種由浙江大學血液分子生物學實驗室保存，人睪丸cDNA文庫、MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3試劑盒購自Clontech公司，限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4 DNA連接酶、pyrobest酶及相關緩沖液購自TaKaRa公司，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.5Plk1與Tara的酵母雙雜交實驗實驗步驟按照Clontech公司酵母雙雜交操作手冊及文獻[4]進行，共獲得18個陽性克隆，提取質粒進行PCR反應,產物經測序鑒定，并與GenBank進行同源性比較。

1.6重組Tara載體轉染、免疫共沉淀實驗及免疫印跡檢測轉染和免疫共沉淀實驗及免疫印跡檢測步驟參照有關說明書及文獻[4]進行操作。

1.7GST融合蛋白純化、體外沉降實驗和Tara蛋白體內外磷酸化實驗GST融合蛋白及GST-Tara融合蛋白體外表達及純化參照Qiagen公司重組GST蛋白純化樹脂說明書操作。純化獲取的重組蛋白質4 ℃保存；體外沉降實驗操作步驟詳見文獻[4]。體外表達并純化GST及GST-Tara融合蛋白后進行體內外磷酸化實驗，步驟詳見文獻[4]。

1.8Plk1磷酸化Tara對胞質分裂及細胞增殖的影響以相應真核表達質粒轉染細胞24 h后，取出蓋玻片，并以相應抗體進行免疫熒光實驗檢測磷酸化Tara對胞質分裂的影響，免疫熒光實驗步驟詳見文獻[4]。分別收集轉染質粒及其對照的HeLa細胞，經PBS洗滌后，4 ℃條件下用體積分數70%冰乙醇固定30 min，離心。細胞重懸于PBS中，加入含有1 mg/L RNA酶的碘化丙啶至20 mg/L，4 ℃避光染色1 h，流式細胞儀檢測細胞增殖情況。

2 結果

2.1Plk1與Tara蛋白酵母雙雜交和免疫共沉淀結果共轉pGADT7-Plk1與pGBKT7-Tara的AH109菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal培養板能夠生長并激活報告基因。在HeLa細胞中，內源性Plk1能夠與Tara抗體發生共沉淀反應，形成復合物，而與對照血清無結合(圖1)。

圖1 Plk1與Tara的免疫共沉淀結果

2.2Plk1與Tara體外沉降和Plk1體內外磷酸化Tara的實驗結果GST-Plk1能夠與His-Tara相結合，形成復合物，而空GST蛋白則不能將His-Tara沉淀下來(圖2)。將Plk1與Tara進行體外磷酸化反應，質譜結果顯示T457是Plk1的磷酸化位點。采用PCR定點突變方法將457位點突變為丙氨酸，體外表達His-Tara T457A及His-Tara WT融合蛋白，再次進行體外磷酸化反應，結果顯示Plk1能夠在體外磷酸化His-Tara WT及對照蛋白，而不能磷酸化His-Tara T457A蛋白 (圖3左)。以100 nmol/L Nocodazole處理HeLa細胞18 h，收集細胞前，再分別加入1 μmol/L DMSO或者Plk1特異性小分子抑制劑GW843682X處理8 h，收集細胞進行免疫共沉淀實驗。結果顯示加入GW843682X處理后，Tara的磷酸化條帶明顯減弱(圖3右)。

2.3Plk1磷酸化Tara對細胞胞質分離的影響免疫熒光結果顯示：過量表達Tara非磷酸化突變體會導致明顯的染色體排列異常(圖4)。

2.4Plk1磷酸化Tara對HeLa細胞增殖的影響流式細胞術檢測結果顯示，轉染GFP-Tara T457A的HeLa細胞4倍染色體發生率為(51.60±3.71)%，轉染GFP空載體、GFP-Tara野生型及GFP-Tara T457E的HeLa細胞4倍染色體發生率分別為(5.69±2.36)%、(6.54±2.69)%和(6.91±3.18)%，4組相比差異有統計學意義(F=74 329.277，P<0.001)。

圖2 Plk1與Tara的體外沉降結果

圖3 Plk1體內外磷酸化修飾Tara結果

圖4 Plk1磷酸化Tara對細胞胞質分離的影響

3 討論

染色體的不穩定性同腫瘤的發生發展密切相關，被認為是腫瘤發生的重要機制[5]。而腫瘤細胞正常的胞質分裂是一個極其精細復雜的多因素、多環節的調控過程。Plk1作為一個在細胞胞質分裂過程中起關鍵作用的磷酸化激酶，在細胞胞質分裂的各個亞環節中均起到了關鍵調控作用[6]。作者此前的研究[7-8]已經證實多種端粒相關蛋白均能夠被Plk1磷酸化修飾進而參與有絲分裂進程的調控，但Plk1調節細胞周期的具體機制目前仍不清楚。Tara蛋白最初作為一個新的F-肌動蛋白結合蛋白被鑒定出來，此前的研究[1]顯示Tara通過調節F-肌動蛋白表達量的變化參與肌動蛋白細胞骨架的形成。而作者之前的研究[3]提示Tara蛋白有可能是同時參與細胞骨架組成及細胞有絲分裂調控的關鍵信號分子，進一步深入探討Plk1及Tara的生物學功能，將為認識細胞骨架組成和胞質分裂之間的聯系提供新的思路。

在該研究中，作者采用酵母雙雜交的方法成功篩選出的Plk1是一個新的Tara結合蛋白。Plk1能夠與Tara在體內外相互結合，能夠在有絲分裂期磷酸化修飾Tara。免疫熒光結果顯示：Tara非磷酸化突變體能夠導致Hela細胞出現大量異常排列的染色體，而野生型和模擬磷酸化突變體則沒有異常表型出現，說明Plk1對Tara的磷酸化修飾對保證細胞正常的胞質分裂是必須的。同時該研究結果顯示：過量表達Tara非磷酸化突變體會導致細胞的增殖明顯受阻，表明Plk1可能通過磷酸化Tara參與了對細胞增殖的調控，這為進一步研究Plk1對細胞周期和細胞增殖調控提供了新的線索。

綜上所述，該研究證明了Plk1能夠磷酸化并調控Tara，Tara的非磷酸化突變體能導致細胞胞質分裂及增殖出現異常。

[1]Seipel K, O’Brien SP, Iannotti E, et al. Tara, a novel F-actin binding protein, associates with the Trio guanine nucleotide exchange factor and regulates actin cytoskeletal organization[J]. J Cell Sci,2001, 114(Pt 2):389

[2]Grisendi S, Bernardi R, Rossi M, et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis[J]. Nature,2005, 437(7055):147

[3]Yu J, Lan J, Zhu Y, et al. The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara[J]. Biochem Biophys Res Commun,2008, 367(4):805

[4]王沖, 余建, 黃河. Plk1 磷酸化修飾 PinX1 對宮頸癌 HeLa 細胞有絲分裂及凋亡的影響[J]. 鄭州大學學報:醫學版, 2013, 48(3):323

[5]Thompson SL, Bakhoum SF, Compton DA. Mechanisms of chromosomal instability[J]. Curr Biol,2010, 20(6):R285

[6]Petronczki M, Lenart P, Peters JM. Polo on the Rise-from mitotic entry to cytokinesis with Plk1[J]. Dev Cell,2008, 14(5):646

[7]Wu ZQ, Yang X, Weber G, et al. Plk1 phosphorylation of TRF1 is essential for its binding to telomeres[J]. J Biol Chem,2008, 283(37):25503

[8]Wang C, Yu J, Yuan K, et al. Plk1-mediated mitotic phosphorylation of PinX1 regulates its stability[J]. Eur J Cell Biol,2010, 89(10):748