rhG-CSF對大鼠缺血缺氧神經元巨自噬水平的影響*

方 立，王雪晶，荊 婧，馬耀華，鄧文靜，張雯雯，滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

自噬是將退變細胞器及長壽命蛋白隔離并運送到溶酶體代謝，以應對各種有害刺激[1-2]。自噬有微自噬、分子伴侶自噬和巨自噬3種形式，通過與溶酶體結合消化大分子物質為其主要特點[3]。證據[4]表明，巨自噬的激活可能在缺血腦組織中起保護作用。重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)是一種造血生長因子，具有促進中性粒細胞系造血祖細胞增殖分化的能力，近來研究顯示其在神經組織的修復中發揮著重要作用。rhG-CSF能顯著減少腦缺血梗死體積，改善早期神經功能[5]。然而rhG-CSF對腦缺血神經細胞保護的具體機制尚不清楚，其對巨自噬的影響也鮮見報道。自噬微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)是巨自噬的標志蛋白。LC3有胞質型(LC3Ⅰ)和膜型(LC3Ⅱ)2種類型。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可反映巨自噬水平的高低。作者觀察了缺血對神經元細胞和腦缺血大鼠腦組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的影響，探討rhG-CSF對巨自噬的調控及其可能的神經保護機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠，體質量(250±30) g，購自河南省實驗動物中心；大鼠神經元SH-SY5Y細胞為中南大學湘雅醫院唐北沙教授饋贈；rhG-CSF購自山東泉港藥業有限公司；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司；單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)和MTT購自美國Sigma公司；LC3一抗購自MBL公司，二抗購自美國Santa Cruz公司；免疫組化二步法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，GAPDH抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2細胞缺氧模型制備與處理SH-SY5Y細胞用DMEM(含體積分數10%胎牛血清)培養液，置于37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度培養箱培養。取對數生長期細胞，用氧糖剝奪法制作細胞缺氧模型。將培養基換為預先以無氧混合氣體(體積分數95%N2+體積分數5%CO2)填充30 min的無糖DMEM培養液；然后將細胞立即置于無氧混合氣體填充的密閉容器中，37 ℃、飽和濕度條件下培養4 h。隨后分別加入0、100、200 μg/L的rhG-CSF，繼續原環境培養48 h。

1.2.1 Western blot檢測細胞LC3蛋白的表達 rhG-CSF處理48 h后，抽提細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，取50 μg樣品經SDS-PAGE電泳，后經轉膜、脫脂奶粉封閉，加入抗LC3抗體(稀釋300倍)4 ℃過夜，次日加入過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(稀釋5 000倍)水平脫色搖床上孵育2 h，用ECL試劑盒使膜上的免疫活性蛋白顯色，暗室中行X線膠片曝光，膠片上蛋白條帶經掃描后用Quantity one進行灰度分析，以GAPDH作為內參照。實驗重復3次。

1.2.2 MDC熒光染色檢測細胞巨自噬空泡 各組細胞rhG-CSF處理48 h后，棄去培養液，多聚甲醛固定15 min，PBS洗3遍，用終濃度為0.05 mmol/L的MDC于37 ℃避光溫育60 min后，吸棄染液，PBS洗滌，熒光顯微鏡下(×400)觀察，各組細胞隨機抽取10個不相重復的視野觀察拍照。流式細胞儀分析。

1.2.3 MTT比色法檢測細胞活力 取對數生長期的SH-SY5Y細胞，調整細胞密度為1×107L-1接種于96孔培養板，過夜貼壁后制備體外缺氧模型，4 h后加入不同濃度的rhG-CSF(0、100、200 μg/L)，每組設8個復孔，體積分數5%CO2培養箱、37 ℃條件下繼續培養48 h。于結束前4 h，每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL；4 h后棄上清培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min左右；結晶物充分溶解后置酶標儀于490 nm波長測吸光度(A)值。細胞活力=實驗孔A值/對照孔A值。

1.3大鼠局灶性腦缺血模型的建立與處理采用改良的Zealonga線栓法建立局灶性腦缺血模型。60只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、rhG-CSF組，每組20只。以水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，取頸部正中切口，分離右側頸總動脈，于近心端距分叉處4 mm切口插入栓線,沿頸內動脈上行,插入長度(19.0±0.5) mm，至大腦中動脈起始部，結扎栓線，以制成局灶性腦缺血模型。假手術組手術過程同上，但不插入線栓。缺血4 h后，假手術組不予藥物處理；模型組腹部皮下注射生理鹽水50 μg/(kg·d)，連續5 d；rhG-CSF組腹部皮下注射rhG-CSF 50 μg/(kg·d)，連續5 d。所有受試動物于注藥7 d后，斷頭快速取腦，自相同斷面(前囟門)將損傷側大腦冠狀切開。一部分用甲醛固定，石蠟包埋切片；另一部分置液氮中凍存備用。

1.3.1 Western blot檢測缺血額葉皮層神經元LC3蛋白的表達 取出液氮中腦組織移入玻璃勻漿管中，加入9倍體積的預冷生理鹽水，冰上充分研碎勻漿。3 500 r/min離心10 min，移棄上清液，按BCA法測蛋白濃度后取50 μg樣品，其余處理同1.2.1。

1.3.2 免疫組化檢測缺血額葉皮層神經元LC3蛋白的表達 石蠟切片常規脫蠟，用檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)熱抗誘導修復(微波3檔20 min)，室溫下冷卻，PBS洗3次，并用H2O2抑制內源性過氧化物酶20 min，PBS洗3次，滴加LC3兔抗人多克隆抗體(稀釋200倍)，4 ℃孵育過夜，PBS再次沖洗，二抗孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素襯染，樹脂封片，顯微鏡下隨機選取10個不同視野的細胞觀察，以細胞中出現棕黃色顆粒為染色陽性細胞。根據陽性細胞的比率評分：≤50%為 3 分，～65%為 4 分，～75%為5分，>75%為6分。

1.3.3 改良的神經功能缺損評分 由不了解實驗分組的人員對動物進行運動(肌肉狀態、異常動作)、感覺(視覺、觸覺、本體感覺)和反射檢查，綜合評價神經系統損傷的嚴重程度。評分最高分為18分，正常為0分，分值越高，說明神經損害越嚴重。各組大鼠藥物干預前進行評分，并于注藥7 d后再次評分。

1.4統計學處理采用SPSS 16.0處理數據。各組SH-SY5Y細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、巨自噬空泡數和細胞活力的比較，以及各組大鼠缺血額葉神經元LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3Ⅱ蛋白表達的比較行單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。各組大鼠不同時間點神經功能缺損評分的比較行重復測量數據的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1rhG-CSF對缺氧SH-SY5Y細胞巨自噬的影響

2.1.1 各組細胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ 比較 見圖1、表1。

圖1 各組細胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比較

2.1.2 各組細胞巨自噬空泡數比較 見圖2、表1。

2.1.3 各組細胞活力的比較 見表1。

2.2動物實驗結果

2.2.1 各組大鼠缺血額葉皮層神經元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比較 見圖3、表2。

圖2 各組細胞巨自噬空泡數比較(×400)

表1 各組細胞巨自噬及細胞活力比較

*:與0 μg/L rhG-CSF組比較，P<0.05；#:與100 μg/L rhG-CSF組比較，P<0.05。

圖3 各組大鼠缺血額葉皮層神經元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ檢測結果

2.2.2 各組大鼠缺血額葉皮層神經元LC3蛋白的表達 見圖4、表2。

圖4 各組大鼠缺血額葉皮層神經元LC3蛋白的表達(SP,×400)

表2 各組大鼠缺血額葉神經元LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ及LC3 Ⅱ蛋白表達(n=20)

*：與假手術組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05。

2.2.3各組大鼠神經功能缺損評分見表3。

表3 各組大鼠神經功能缺損評分比較(n=20)

F組間=20.403,F時間=19.193,F交互=33.415,P均<0.001。

3 討論

研究[6]表明，巨自噬作為一種應激反應，參與了腦缺血的病理生理過程。研究[7]表明rhG-CSF參與了中樞神經系統修復過程。rhG-CSF可減少缺血病灶大小，抑制水腫形成，有抗炎和抗凋亡作用，可以改善中風結局[8]。rhG-CSF還能動員干細胞向病損部位遷移,修復壞死組織[9]。該研究發現，體外細胞缺氧模型rhG-CSF給藥組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、巨自噬空泡數及細胞活力均高于未加藥組，且隨給藥濃度增加，自噬活性及細胞活力均逐漸增強。大鼠腦缺血模型rhG-CSF干預后第7天，模型組缺血額葉皮層神經元的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3表達水平均高于假手術組，提示局灶性腦缺血后神經元巨自噬水平升高，缺血腦組織可能通過增強自噬促進自我修復；而rhG-CSF組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及LC3表達水平又較模型組增高，表明rhG-CSF干預可上調局灶性腦缺血后神經元的巨自噬水平。rhG-CSF組較模型組大鼠神經功能缺損評分降低，說明神經功能恢復明顯，提示rhG-CSF有修復神經的作用。

研究[10]發現當巨自噬清除線粒體后神經細胞死亡也并非不可避免。Lockshina等[11]認為細胞輕度受損后，自身首先通過激活自噬途徑以清除有害蛋白。缺血再灌注時活性氧(ROS)是自噬的主要誘導因素?；钚匝跽T導線粒體損傷、功能紊亂，線粒體通透性轉換孔開放和形成線粒體碎片，這反過來又促進自噬及自噬清除線粒體?；钚匝跹趸⒁种瓢腚装彼岬鞍酌窤tg4的活化，導致LC3的脂化和自噬體形成[12]。自噬體吞噬消除受損的線粒體，減少活性氧生產，抑制促凋亡因子如細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡[13]。研究[14]發現短暫腦缺血后，腦組織的自噬標記物表達上調，同時神經細胞增加，顯示自噬激活是一個潛在的腦損傷早期保護機制。Yan等[15]也發現通過藥物預處理調節自噬激活可能減輕缺血細胞損傷。該研究發現rhG-CSF干預下局灶性腦缺血大鼠神經細胞自噬水平升高，大鼠神經功能恢復，且神經元細胞活力增加，提示rhG-CSF能夠上調腦缺血后巨自噬活動，并促進神經功能的修復。

總之，缺血缺氧損傷后，rhG-CSF可能通過調控巨自噬水平起到保護神經元的作用。

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