非小細胞肺癌組織中Nanog的表達*

駱梅青，卜 慶，曹軼林，鄭桂銀，伍愛華

桂林醫學院附屬醫院腫瘤內科 桂林 541001

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居全球首位。目前最新理論[1]認為腫瘤是一種干細胞疾病，惡性腫瘤中存有數量極少的腫瘤干細胞，在腫瘤的形成和生長中起著決定性作用，這些腫瘤干細胞具有無限增殖、自我更新及分化的能力，并表達相似的分子標記和基因產物。 Nanog在2003年由Chambers等[2]報道,為腫瘤干細胞標記物，在維持細胞自我更新和保持全能性中發揮重要作用，可促進腫瘤的增生、侵襲和轉移，目前在乳癌、肝癌、前列腺癌及結腸癌等惡性腫瘤中都有報道[3-4]。作者通過免疫組化方法和實時熒光定量PCR方法檢測了NSCLC組織中Nanog的表達，并進一步探討Nanog的表達與NSCLC患者臨床病理因素及預后的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象桂林醫學院附屬醫院2005年1月至2007年3月手術切除或經頸胸腔鏡活檢的NSCLC標本106例，男81例，女25例。患者年齡35～75歲,中位年齡50歲。106例中鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)57例,腺癌49例，均經病理明確診斷。病理分級：Ⅰ級39例，Ⅱ級34例，Ⅲ級33例。T分期：T1～261例，T3～445例；N分期：N059例，N1～347例。另取10例正常肺組織標本(為明確診斷而行CT下肺穿刺或纖支鏡檢查，病理診斷為正常肺組織)作對照。標本一部分液氮保存，另一部分石蠟包埋切片。所有患者術前均未做化療、放療, 有完整的臨床和隨訪資料；隨訪至2012年9月，生存期為確診之日至死亡或末次隨訪時間。

1.2主要試劑鼠抗人Nanog單克隆抗體購自美國Cell Signal公司,SP法免疫組化試劑盒及DAB顯色劑購自福州邁新生物技術開發公司。Trizol購自Invitrogen公司,逆轉錄試劑盒為美國Ferments公司產品,SYBR Green PCR為 TaKaRa公司產品，實時熒光定量PCR儀為美國安捷倫公司產品。其他常規分子生物學試劑均購自Sigma公司。

1.3NSCLC和正常肺組織中Nanog蛋白的檢測

實驗步驟嚴格按照免疫組化SP試劑盒說明進行。石蠟切片常規脫蠟至水后，體積分數3%過氧化氫溶液室溫下孵育15 min，高壓抗原修復2 min后冷卻至室溫，滴加山羊血清,室溫下孵育10 min,棄血清,滴加一抗工作液(按1100稀釋),4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標記的二抗,37 ℃孵育10 min，DAB顯色，自來水反復沖洗，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水,二甲苯透明，中性樹膠封片。用 PBST代替一抗作陰性對照。SP染色陽性反應物呈棕黃色。采用半定量積分法判定結果, 每張切片選5個高倍視野,計數100個細胞,陽性細胞百分比≤5%為0分,～25%為1分,～50%為2分,～75%為3分,>75%為4分;根據免疫陽性細胞染色程度,黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。兩項積分相乘,0～1分為陰性，≥2分為陽性[5]。

1.4NSCLC和正常肺組織中NanogmRNA的測定取10～15 mg液氮保存的組織標本，Trizol提取RNA，逆轉錄合成cDNA。PCR反應體系為20 μL，Nanog上游引物：5’-CAGAAGGCCTCAGCACCTAC-3’,下游引物：5’-ATTGTTCCAGGTCTGGTTGC-3’，擴增產物大小為111 bp。內參β-actin上游引物：5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，下游引物5’-CCA GAGGCGTACAGGGATAG-3’，擴增產物大小為152 bp。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個循環。實時熒光定量PCR儀自動生成Ct并繪制標準曲線及融解曲線。所生成的Ct值取均值后代入標準曲線，得出目的基因的表達量。

1.5統計學處理采用SPSS 13.0處理數據。采用確切概率法比較NSCLC和正常肺組織中Nanog蛋白陽性表達率的差異,χ2檢驗比較不同人口學特征和臨床病理特征的NSCLC患者Nanog蛋白陽性表達率的差異。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，log-rank檢驗進行生存分析。采用單因素方差分析比較NSCLC和正常肺組織及不同病理級別的NSCLC組織中Nanog mRNA表達量的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同組織中Nanog蛋白的表達Nanog蛋白陽性染色為棕黃色顆粒, 主要分布于NSCLC細胞胞核中，見圖1。NSCLC組織中Nanog蛋白陽性表達率為24.5%(26/106)，而在正常組織中未見表達，2者相比，差異有統計學意義(P=0.114)。

圖1 正常肺組織(A)、肺鱗癌組織(B)和肺腺癌組織(C)中Nanog蛋白的表達(SP，×400)

2.2Nanog蛋白的表達與NSCLC患者一般人口學特征及臨床病理特征的關系結果見表1。

2.3Nanog蛋白的表達與NSCLC預后的關系生存曲線見圖2、3。肺鱗癌患者中Nanog蛋白陰性表達者及陽性表達者的M(T25，T75) 分別為36(20，60)和32(16，36)個月，Nanog蛋白的表達與肺鱗癌患者的預后無關(χ2=0.013，P=0.917)，但肺腺癌患者中Nanog蛋白陰性表達者及陽性表達者的M(T25，T75) 分別為48(36，56)和33(14，57)個月，Nanog陰性表達者預后較好(χ2=5.352，P=0.020)。

表1 Nanog蛋白的表達與NSCLC患者一般人口學特征及臨床病理特征的關系

圖2 Nanog蛋白的表達與肺鱗癌患者預后的關系

圖3 Nanog蛋白的表達與肺腺癌患者預后的關系

2.4不同組織中NanogmRNA的表達Nanog mRNA在正常肺組織中的表達量(0.277±0.190)明顯低于NSCLC組織(0.950±0.183)，2者相比，差異有統計學意義(F=122.662，P<0.001)；Nanog mRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級NSCLC組織中的表達量分別為(0.831±0.194)、(0.905±0.144)和(1.076±0.123)，3者相比，差異有統計學意義(F=4.047,P=0.020)。

3 討論

目前腫瘤干細胞理論認為，腫瘤細胞由數量較少的腫瘤干細胞和大多數表型不同的腫瘤分化細胞組成[6]。腫瘤干細胞數量較少但難以清除的特點是導致腫瘤治療效果差、生存期短的主要原因[7]。Nanog基因是胚胎發育早期的轉錄因子之一，在胚胎發育過程中維持正常的組織分化和個體發育；Nanog基因也是體外誘導iPS的主要基因之一，為腫瘤干細胞標記物?；谶@種觀點，檢測調控腫瘤干細胞自我更新的關鍵基因Nanog的表達在腫瘤研究中具有重要意義[8]。目前研究[9]表明，Nanog除了能在生殖細胞系及生殖細胞來源的惡性腫瘤細胞中表達外，在肺癌組織中也有表達。

該研究結果表明，Nanog蛋白在NSCLC組織中的陽性表達率高于正常肺組織，提示Nanog蛋白的表達可能與NSCLC的發生有關。此外，Nanog蛋白的表達與腫瘤的組織學類型有關，在腺癌中的表達明顯高于鱗癌，與文獻[10]的研究結果一致。同時，該研究結果還顯示，Nanog蛋白的陽性表達率隨著病理級別的增高有升高的趨勢，提示Nanog蛋白的表達可能與NSCLC的惡性程度有關。另有文獻[11]報道，在腎細胞癌中Nanog為抑癌因素，提示在不同類型腫瘤的發生發展過程中，即使是同一種基因也會發揮不同的作用。

該研究結果還顯示，與正常肺組織相比，Nanog mRNA在NSCLC組織中高表達，并且隨病理級別的增高有升高的趨勢。有些學者[12]認為其原因可能為導致間充質細胞轉化的發生，但闡明其具體機制還需相關實驗進一步驗證。體外實驗[13-14]表明，干細胞標記物會隨著干細胞分化程度的增高而減少，這與文獻[15]報道的腫瘤干細胞標記物與肺癌組織的不同分化程度有關相一致。

此外，該研究結果還顯示，Nanog蛋白的表達與肺鱗癌的預后無關，但與肺腺癌的預后有關，Nanog蛋白陰性表達者預后較好。曾有報道[16]發現干細胞相關因子主要在肺腺癌中表達，但從 Nanog角度國內外尚未有相關報道。

綜上所述，Nanog蛋白和mRNA在NSCLC組織中高表達，可能與NSCLC的發生發展有關；Nanog蛋白的表達與肺腺癌的預后有關。該研究結果可能為分析NSCLC的生物學行為、進一步開展新的基因治療提供幫助。

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