脂肪來源干細胞復合不同生物支架在裸鼠皮下的促血管化作用

徐永飛，張建文，暴志國，李靜怡，王耀聰，許穎溦

鄭州大學第一附屬院整形外科 鄭州 450052

自體脂肪移植是理想的修復軟組織缺損的方法，但移植的脂肪組織成活率低，限制了其在臨床上的推廣及應用[1-2]。但大多數組織工程以固態支架為主，不能適應微創醫學美容整形的發展。自體脂肪移植應用于美容外科具有很多優點,可代替其他生物制品進行凹陷填充或去除輕微的皺紋,而無過敏或排異反應,減少并發癥的出現[3]。細胞支架材料可以選擇脂肪抽吸中的脂肪顆粒和可降解的注射充填材料(透明質酸鈉、膠原等),種子細胞可以選擇人體容易獲得的脂肪來源干細胞。作者將種子細胞和細胞支架混合,形成細胞-支架復合物,以此探討這種材料作為脂肪組織工程載體材料的可行性。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗試劑 Ⅱ型膠原酶(Gibco公司，美國)，胎牛血清[賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司]，DMEM培養液、PBS液和胰蛋白酶(北京Solarbio公司)，堿性成纖維細胞生長因子(北京雙路藥業)。

1.1.2 主要儀器 組織勻漿機、純水系統、恒溫CO2培養箱(Thermo Scientific，上海)、低溫臺式離心機(Eppendorf，德國)、超凈工作臺(VL-4S，珠海市再鑫儀器有限公司)。

1.1.3 支架材料 脂肪組織來源于鄭州大學第一附屬醫院2012年8月臨床吸脂患者抽取組織。患者，女，23歲，身體健康，抽取雙下肢股外側及股后側脂肪組織100 mL。透明質酸鈉、Ⅰ型膠原支架(Sigma公司，美國)。

1.1.4 實驗動物 裸鼠12只，4周齡,體質量15～30(20.3±2.3) g，雄性，由鄭州大學第一附屬醫院重點實驗室提供，所有動物均在無菌環境下用標準飼料進行飼養。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2脂肪來源干細胞的分離與培養膠原酶消化脂肪組織，分離收集原代脂肪來源干細胞，按4×105mL-1接種于培養瓶內，加入低糖DMEM+體積分數10%胎牛血清培養液培養,收集第3代細胞作為種子細胞，DⅡ熒光標記[4]。

1.3脂肪來源干細胞-生物支架復合物制備、植入和取材實驗分為4組，A組為脂肪顆粒，B組為透明質酸鈉，C組為Ⅰ型膠原支架，分別與25×106mL-1的脂肪來源干細胞按照體積比11混合，D組為單純脂肪來源干細胞，每一樣本于裸鼠背部皮下注射0.2 mL,每只裸鼠各注射4個點。3個月后處死動物，分別沿每只裸鼠4個注射點縱向切開皮膚，沿移植物被膜外分離，完整取出移植物，測量體積。

1.4新生組織塊濕質量、存活率及微血管密度測定

濕質量：沿移植物被膜外分離，完整取出移植物，立即以電子天平稱濕質量。存活率:存活率=術后復合組織塊體積/術前復合組織塊體積(0.2 mL)×100%。微血管密度：組織塊進行HE染色和免疫組化染色,采用小鼠抗兔CD31抗體作為一抗，按照免疫組化SP試劑盒操作步驟進行染色，DAB顯色，蘇木素復染，染成棕色或棕黃色的單個細胞或細胞叢即為血管，用XSZ-81型光學顯微鏡觀察，在切片中選擇10個視野(×200)，計數每個視野中微血管數，取其平均值。

1.5統計學處理數據采用SPSS 18.0進行分析，采用重復測量數據的方差分析比較4組間濕質量、存活率及微血管密度的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1大體觀察取材時，裸鼠背部均無脂肪組織，界限清晰，包膜完整，易分離，脂肪組織形狀不規則，大小不一。A、B、C組組織塊明顯大于D組。見圖1。

圖1 術后各組新生組織塊大體觀察結果

2.2濕質量、存活率、微血管密度比較A、B、C組濕質量、存活率、微血管密度均高于D組。見表1。

表1 各組新生組織塊濕質量、存活率、微血管密度比較(n=12)

*：與其他3組比較，P均<0.05。

2.3新生組織塊HE及免疫組化染色與D組比較，A、B、C組脂肪結構保持較完整，且血管結構典型、數量較多。見圖2。

3 討論

近年來隨著醫學的發展，應用組織工程技術研究可注射性軟組織充填物是一個新的發展方向，其中理想的種子細胞來源及生物支架的構建是工程化研究成功的關鍵。

圖2 各組新生組織塊HE及免疫組化染色結果(×200)

脂肪來源干細胞為從脂肪組織中分離出來的具有多分化潛能的成體干細胞，在體外可以誘導分化為脂肪細胞、軟骨細胞、神經細胞、肌細胞等，更重要的是其還可以分泌多種促血管化的細胞因子，促進移植物的血管化，提高存活率。脂肪來源干細胞已在組織修復及美容外科中發揮了巨大的作用，是組織工程中較常用的種子細胞[5]。

脂肪顆粒、透明質酸鈉和膠原等可作為生物支架并與脂肪來源干細胞具有一定的協同作用。其中脂肪顆粒來自于自身組織，無明顯排異反應，可為種子細胞提供很好的微環境和生物支架。研究證實脂肪來源干細胞在向脂肪細胞轉化的同時也可向血管內皮細胞分化[6-8]，并分泌EGF、FGF等生長因子[9]，改善局部血液循環，促進局部細胞增生分裂，從而減少細胞缺血時間、降低細胞液化吸收率，使脂肪來源干細胞和脂肪顆粒具有一定的協同作用。非動物源性的透明質酸鈉是一種天然的高分子多糖，是世界上公認的保濕劑，很容易發生降解。透明質酸具有非抗原性，很少引起炎癥和異物反應。因其無致敏性、容易獲得且本身就是細胞基質成分,作為組織工程支架具有廣闊的前景。膠原是屬于細胞外基質的結構蛋白質，廣泛存在于脊椎動物和人的皮膚、肌腱、韌帶、軟骨及骨等組織或器官中，其主要成分是糖蛋白，約占機體總蛋白的25%。膠原具有很好的生物學性能，是目前組織工程研究中最常用的天然生物支架材料[10]。因此作者選擇這3種材料作為該研究的細胞支架材料[11-14]。

作者發現，與無支架的單純脂肪來源干細胞相比，脂肪來源干細胞-生物支架復合物在裸鼠軟組織中血管化作用比較明顯，且3種支架的促血管化作用無差異。該結果證明了這3種材料作為組織工程中生物支架的可行性，為臨床脂肪來源干細胞移植中生物支架的選擇提供了理論依據。

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