益肺活血復方對人肺動脈內皮細胞微結構及內分泌功能的影響*

王 婷，歐 敏，黃友章

中國人民解放軍海軍總醫院干部呼吸科 北京100048

大量研究[1-2]表明，低氧造成的肺血管內皮細胞功能紊亂和平滑肌收縮是發生肺動脈高壓的主導因素。肺血管內皮細胞不僅是血管內壁的屏障，而且分泌釋放多種生物活性物質調節血管張力和平滑肌增殖，參與凝血劑抗血栓形成，影響血管通透性和物質交換。其中，內皮素-1(endothelin-1，ET-1)是內皮細胞分泌的最強的血管收縮因子，而內皮源性舒張因子主要為一氧化氮(nitric oxide，NO)和花生四烯酸代謝產物前列環素(prostacyclin，PGI2)。益肺活血復方是董建華院士臨床治療肺心病的一組中藥復方，既往研究[3-4]表明，在動物實驗水平上，益肺活血復方可抑制中膜增厚、減輕血管縮窄、降低肺動脈高壓。臨床上低氧常伴有二氧化碳的增高，因此該實驗采用體外低氧高二氧化碳環境下培養的人肺動脈內皮細胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)，研究益肺活血復方對HPAECs微結構及分泌ET-1、NO及PGI2的影響，從而探討其在肺動脈高壓治療中的作用。

1 材料與方法

1.1動物與細胞雄性新西蘭大耳白兔20只，清潔級，體質量(2.00±0.02) kg[北京市房山區官道順利養殖場提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0004]，以標準動物飼料飼養，飼養室內環境溫度保持在18～29 ℃。HPAECs購自美國ScienCell公司。

1.2儀器及試劑低氧高二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；DMEM/F12培養液(美國M&G公司)，NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1及PGI2放射免疫測定試劑盒(北京華英生物技術研究所)。

1.3藥物益肺活血復方(黃芪100 g、潞黨參120 g、白術60 g、當歸90 g、桃仁120 g、紅花90 g、牛膝80 g、川芎50 g、赤芍60 g、陳皮70 g、柴胡50 g、桔梗50 g、枳殼60 g、甘草30 g、生地黃90 g)加重蒸水1 500 mL，同時煎沸20 min,過濾2次后合并2次濾液，4 000 r/min離心15 min后取上清液，濃縮至含生藥0.001 g/L。

1.4含藥血清的制備20只新西蘭大耳白兔采用隨機數字表法分為4組：空白對照組及低、中、高劑量益肺活血復方組，每組5只。每天2次分別以中藥低劑量(10 g/kg)、中劑量(20 g/kg)、高劑量(40 g/kg)灌胃，空白對照組以等體積的生理鹽水灌胃，連續7 d。末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12 h)給藥2 h后腹主動脈采血，離心后分離血清，合并同組含藥血清，0.22 μm微孔濾膜過濾后，-80 ℃保存備用。

1.5細胞培養、分組及干預HPAECs于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養，細胞貼壁生長，呈多角形、鋪路石樣外觀；待細胞生長至80%融合后用胰蛋白酶消化傳代1次，方法參照美國ScienCell公司產品說明書。選用3～5代的細胞用于實驗。將HPAECs細胞懸液接種到含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12培養液中，在37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養至細胞70%融合后，分組并干預。空白對照組：體積分數21% O2、體積分數5% CO2條件下加入含體積分數10%空白對照組血清的DMEM/F12培養液；模型組：體積分數5% O2、體積分數8% CO2條件下加入含體積分數10%空白對照組血清的DMEM/F12培養液；低、中、高劑量益肺活血復方組：體積分數5% O2、體積分數8% CO2條件下加入含體積分數10%低、中、高劑量益肺活血復方組含藥血清的DMEM/F12培養液。各組細胞分別培養12 h后收集細胞培養液上清或細胞用于檢測。

1.6細胞微結構的透射電鏡觀察共同孵育12 h后，各組細胞經PBS液漂洗3次后，用體積分數2.5%的戊二醛4 ℃固定1 h，然后用10 g/L鋨酸4 ℃固定120 min，再進行梯度乙醇脫水、環氧丙烷置換及包埋，最后進行連續超薄切片及電鏡觀察。

1.7細胞培養液上清ET-1及PGI2含量的測定共同孵育12 h后，收集各組細胞培養液上清，置于-20 ℃冰箱儲存備測。ET-1和PGI2測定均采用放射免疫法，嚴格按試劑盒說明進行操作。ET-1檢測靈敏度<0.005 pg/L，批內變異<10%，批間變異<15%。PGI2檢測靈敏度<0.025 pg/L，批內變異<3.5%,批間變異<10%。實驗重復6次。

1.8細胞培養液中NO含量的硝酸還原酶法測定

將生長良好的HPAECs接種于12孔培養板，待細胞生長至70%融合時，按1.5分組加不同的含藥血清干預，12 h后取細胞培養液100 μL，按照NO測定試劑盒說明進行操作。用721型分光光度計測定550 nm處的吸光度，并計算NO含量。實驗重復6次。

1.9統計學處理應用SPSS 13.0處理數據，采用單因素方差分析比較5組細胞培養液或培養液上清中ET-1、NO及PGI2含量的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1細胞微結構的透射電鏡觀察與空白對照組相比，透射電鏡下模型組可見細胞損傷，細胞膜不完整，胞質溶解，出現裸核，核周間隙擴張，核膜內外層之間分開；線粒體及內質網擴張，膜不完整。與模型組相比，低劑量益肺活血復方組細胞同樣呈現較重的細胞損傷，而中、高劑量益肺活血復方組細胞損傷較模型組明顯減輕。見圖1。

圖1 透射電鏡下各組HPAECs微結構的改變

2.2益肺活血復方含藥血清對HPAECs分泌ET-1、NO及PGI2的影響各組細胞處理12 h后，模型組ET-1含量高于空白對照組；而與模型組相比，中、高劑量益肺活血復方組ET-1含量減少。模型組NO和PGI2含量低于空白對照組；而與模型組相比，中、高劑量益肺活血復方組NO及PGI2含量增高。見表1。

表1 各組HPAECs細胞培養液或培養液上清中ET-1、NO及PGI2含量比較(n=6)

*:與空白對照組比較，P<0.01；#:與模型組比較，P<0.01。

3 討論

研究[5]表明，肺血管內皮細胞損傷在低氧性肺動脈高壓的發生發展中起著重要的作用。肺血管內皮細胞不僅具有屏障功能，而且是許多血管活性物質合成、代謝的主要場所。低氧使血管內皮細胞水腫，甚至凋亡，導致細胞屏障功能受損；另一方面還導致內源性肺血管舒張和收縮物質分泌失衡。益肺活血復方是治療慢性肺心病的經驗方[3-4]。

低氧條件下內皮細胞水腫，失去正常排列，細胞質中出現顆粒，粗面內質網擴張，線粒體腫脹且嵴較模糊，胞質內出現巨大空泡；內皮細胞結構受損大大降低了細胞屏障功能。ET-1主要由內皮細胞分泌，在維持機體血管緊張性方面發揮重要作用，能引起強烈的血管收縮，促進平滑肌細胞、成纖維細胞的增殖，最終導致血管重塑和肺動脈高壓的形成。研究[6]發現，低氧能引起培養的血管內皮細胞ET-1基因轉錄和肽合成的增加。內皮細胞分泌的內皮源性舒張因子主要為NO和花生四烯酸代謝產物PGI2。肺血管內皮細胞產生的NO可迅速擴散進入血管平滑肌細胞，進而松弛平滑肌[7]。NO還可以直接抑制血管平滑肌細胞增生，抑制血管重塑[8-9]。王慧等[10]研究發現，低氧可導致大鼠肺血管內皮功能障礙，NO生成減少；而PGI2由表達于內皮細胞內質網和平滑肌細胞核膜及質膜上的前列環素合酶參與合成，具有較強的血管舒張和抗有絲分裂活性，現已廣泛運用于臨床治療肺動脈高壓。

該研究發現，低氧高二氧化碳造成HPAECs的細胞微結構受損，且低氧下HPAECs分泌的ET-1明顯高于常氧組，NO和PGI2明顯低于常氧組。而中、高劑量的益肺活血復方含藥血清能減輕細胞結構的損傷程度，減少HPAECs分泌ET-1，促進其分泌NO和PGI2。因此，作者推斷益肺活血復方可能通過減輕HPAECs結構損傷的程度從而改善其內分泌功能；或者益肺活血復方可直接影響內皮細胞血管活性物質生成的某個環節，并在肺動脈高壓的治療中發揮一定的作用。但其調控內皮細胞分泌功能的具體機制還需進一步研究。

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