食管鱗癌細胞中PTEN基因表達水平及突變位點分析*

侯桂琴，貝維娟，楊 帥，王瓊葉，魯照明#

1)鄭州大學藥學院臨床藥學系 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院消化科 鄭州 450052

PTEN(phosphatase and tensine homolog deleted on chromosome 10)基因是迄今發現的第一個具有雙磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10[1]，通過雙磷酸酶活性對多條細胞信號轉導通路進行去磷酸化調節，從而實現對細胞生長的負調控。它的主要功能是誘導細胞凋亡，抑制細胞生長、遷移和黏附以及參與胚胎正常發育和維護免疫系統穩定性[2-3]。PTEN在很多腫瘤組織中缺失或低表達，尤其在子宮內膜癌、前列腺癌、神經膠質母細胞瘤和黑色素瘤等惡性腫瘤組織中突變率較高[4-5]。PTEN基因的突變、失活與腫瘤的發生發展密切相關[4,6]。食管鱗癌是最常見的惡性腫瘤之一，有報道[7]證實食管鱗癌組織中存在PTEN缺失或低表達。作者采用RT-PCR方法檢測了EC9706、Eca109和EC1等3種食管鱗癌細胞株細胞中PTEN mRNA的表達水平，然后從這3株細胞中克隆出PTEN基因全長并分析其突變位點，為探討PTEN在食管鱗癌發生發展中的作用及食管鱗癌的基因診斷和治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑EC9706購自上海中科院細胞庫，EC1、Eca109及大腸桿菌JM109由課題組長期保存；RPMI 1640培養基、胰蛋白酶及胎牛血清購自Gibco公司；pcDNA3.1(+)載體購自Invitrogen公司；pMD18-T載體、BamHⅠ、HindⅢ、一步法RNA PCR試劑盒、Taq酶、dNTP、DNA Marker、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自大連寶生物公司；反轉錄試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3細胞培養3種細胞均用含體積分數10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液，于37 ℃、體積分數5% CO2及飽和濕度條件下培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4PTENmRNA的RT-PCR檢測用Trizol試劑提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測定RNA純度，用甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。將總RNA用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，利用PTEN檢測引物行PCR。PCR反應體系25 μL，其中含cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL。擴增條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃終止。取5 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳。實驗重復3次。采用BandScan 5.0對電泳條帶進行灰度分析，以目的基因與內參條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的表達水平。

1.5PTEN全基因序列的擴增提取細胞總RNA，采用一步法RNA PCR試劑盒,按照操作說明擴增細胞中PTEN全基因序列。PCR擴增條件: 50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 6 min，共35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。取 5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6PTEN基因突變位點的分析用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳回收全基因序列擴增的目的片段，與pMD18-T 載體16 ℃連接過夜,構建重組質粒pMD18-PTEN。將重組質粒轉化感受態JM109受體菌，然后將其涂布于含50 mg/L氨芐西林(Amp) 的LB瓊脂平板，37 ℃培養14～16 h。從平板上隨機挑取白色菌落，接種于含Amp的LB液體培養基中，37 ℃振蕩過夜培養。提質粒，HindⅢ和BamHⅠ 37 ℃雙酶切。把酶切鑒定正確的質粒送生物公司測序。將測序結果與GenBank上野生型PTEN基因序列進行比對，分析突變位點。為了減少誤差，每個質粒同時分別送3家公司測序，將兩家以上公司測出的共同突變點作為基因突變位點。

1.7統計學處理采用SPSS 10.0處理數據。3株細胞中PTEN mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3株食管鱗癌細胞中PTENmRNA的表達水平提取的總RNA經瓊脂糖電泳顯示18S、28S兩條帶(圖1)，紫外分光光度計測定A(260 nm)/A(280 nm)>1.8，說明RNA的純度和完整性符合PCR要求。RT-PCR結果(圖2)顯示，EC1、EC9706、Eca109細胞中PTEN mRNA 的表達水平分別為(0.06±0.02)、(0.24±0.02)、(0.41±0.01)，3株細胞中PTEN mRNA的表達水平差異有統計學意義(F=306.330，P<0.001)，Eca109細胞中PTEN mRNA的表達水平高于EC9706和EC1細胞(P<0.05)。

圖1 3株細胞總RNA提取結果

圖2 3株細胞中PTEN mRNA的表達

2.2PTEN全基因序列擴增結果采用一步法RNA PCR試劑盒擴增PTEN基因，經過瓊脂糖凝膠電泳(圖3)，可在1 500 bp附近見到一清晰的條帶。

圖3 3株細胞中PTEN全基因PCR擴增結果

2.3 3株食管鱗癌細胞中PTEN基因突變位點分析將重組質粒pMD18-PTEN轉入感受態細菌JM109后，進行藍白斑篩選，挑取白色菌落，擴大培養，提取質粒，進行雙酶切鑒定，可以觀察到1 500 bp和3 000 bp附近各有一條清晰的條帶(圖4)。將測序結果與野生型PTEN基因序列比對，找出從起始密碼子(ATG)開始到終止密碼子(TGA)間的突變，即編碼區的突變。3株細胞的突變位點見表1～3。

圖4 重組質粒的雙酶切鑒定結果

表1 EC9706細胞PTEN基因突變分析

表2 Eca109細胞PTEN基因突變分析

表3 EC1細胞PTEN基因突變分析

3 討論

PTEN基因是1997年發現的第一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，該基因包含9個外顯子和8個內含子[1-2]。PTEN cDNA編碼的蛋白由403個氨基酸組成，相對分子質量約55 000[1-2]。PTEN蛋白有兩個比較重要的結構域：C端磷酸酶結構域和N端磷酸酶結構域。C端結構域包含蛋白質酪氨酸磷酸酶(PTP)催化區，它的結構與雙特異性磷酸酶相似，可使 3, 4, 5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3) 和局部黏附激酶(FAK) 去磷酸化，從而誘導細胞凋亡[2,8]。N端結構域與細胞骨架蛋白tensine和auxilin高度同源，這一特點在維持細胞結構和調控信號轉導中起到了重要作用。因此PTEN的主要作用為：抑制細胞的遷移、延伸和局部黏附；參與胚胎正常發育，通過阻滯細胞于G1期或誘導細胞凋亡，抑制細胞的生長及端粒酶活性等[9]。

許多研究證實PTEN mRNA表達隨細胞分化程度降低而降低。Zainuddin等[10]報道影響PTEN mRNA表達的因素復雜，一方面各種轉錄因子活性可對PTEN mRNA的轉錄產生影響，另一方面PTEN 5’端的非翻譯序列也可影響其轉錄，此外5’端CPG島甲基化可封閉轉錄。Weng等[11]報道，通過對前列腺癌細胞的去甲基化可以恢復PTEN mRNA 的表達水平，由此得出啟動子區的甲基化可能是PTEN表達降低或缺失的原因之一。作者的檢測結果也顯示，高分化的Eca109細胞PTEN mRNA的表達水平明顯高于其他兩種低分化食管鱗癌細胞EC9706和EC1，說明在食管鱗癌細胞中，PTEN mRNA的表達與腫瘤的分化程度相關，其表達水平隨著分化程度的降低而降低，但其機制還有待進一步研究。

PTEN是繼p53基因之后，又一個突變率高且與腫瘤發生有密切關系的抑癌基因。目前已發現PTEN基因在多種腫瘤中存在突變，如乳癌、前列腺癌、子宮內膜癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、肺癌、腎癌、肝癌等[5, 12-13]。PTEN基因一旦發生突變，其磷酸酶活性就會顯著降低，從而失去對細胞生長的負調控，使得腫瘤細胞增殖能力增強[14]。作者的研究結果顯示，從3株食管鱗癌細胞中克隆出的PTEN基因均存在外顯子的突變，且突變均為錯義突變或無義突變。EC9706細胞PTEN基因突變出現在第2、5、6、8外顯子，其中第5和第8外顯子各出現兩處突變；而Eca109細胞PTEN基因突變出現在第5、8和9外顯子；EC1細胞PTEN基因突變出現在第6、8、9外顯子。研究結果證實在食管鱗癌細胞中PTEN基因突變位點多出現在第5、8外顯子，這與國外報道的PTEN在其他腫瘤中的突變熱點集中在第5、8外顯子基本相符[15]。

綜上所述，作者推測PTEN基因突變在食管鱗癌的發生中起著重要的作用。今后作者將進一步通過定位突變技術，對食管鱗癌細胞中PTEN基因突變進行深入研究，以了解PTEN基因突變尤其是熱點突變如何具體影響其編碼蛋白的結構和功能，從而探討PTEN突變在食管鱗癌發生中的具體作用。

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