谷氨酸鈉對PC12細胞鈉離子通道蛋白1.7表達的影響*

潘幀婕，曹 靖，李 鳴，任秀花，王劍南，邵金平，臧衛東

鄭州大學基礎醫學院人體解剖學教研室 鄭州 450001

電壓門控鈉離子通道1.7的α亞單位(Nav1.7α)由SCN9A基因所編碼(定位于染色體2q24.3)，包括26個外顯子，其主要表達在背根脊神經節細胞和交感神經節細胞[1]。SCN9A基因的突變與3種先天性疾病有關：原發性紅斑肢痛癥、陣發性劇痛癥和先天性無痛癥[2-3]，說明Nav1.7α可能在疼痛的發生發展過程起重要作用。該實驗利用谷氨酸鈉刺激PC12細胞模擬疼痛刺激，觀察Nav1.7表達量的變化，以判斷在細胞水平Nav1.7的表達量與疼痛刺激的關系。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器谷氨酸鈉(美國Amresco公司，產品批號CAS#987-65-5)，DMEM(北京Solarbio公司)，胰蛋白酶、滅活胎牛血清(中國四季青公司)，Nav1.7兔抗鼠多克隆抗體(美國Abcam公司)；激光共聚焦顯微鏡(日本蔡司公司)，PCR儀(德國Biometra公司)，低溫離心機(德國Heraeus公司)，普通離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2細胞培養PC12細胞由鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室提供，培養于DMEM培養基中，其中含體積分數10%滅活胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 μg/L鏈霉素。細胞置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養，隔天換液，待細胞長至70%～80%融合后，2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.3實驗分組實驗分為對照組和不同濃度的谷氨酸鈉刺激組。①對照組：用正常DMEM培養基培養PC12細胞。②不同濃度的谷氨酸鈉刺激組：在培養液中分別加入終濃度為5、10、20、40 nmol/L的谷氨酸鈉，與PC12細胞共培養14 h。對照組與谷氨酸鈉刺激組培養條件一致。

1.4不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細胞Nav1.7表達的免疫熒光檢測PC12細胞分別用0、5、20、40 nmol/L谷氨酸鈉培養14 h后用PBS沖洗3遍，采用40 g/L多聚甲醛固定30 min，用PBS沖洗5遍。經體積分數0.4% Triton 37 ℃通透10 min, PBS沖洗5遍。底物用含體積分數3% H2O237 ℃孵育10 min, PBS沖洗5遍。山羊血清37 ℃孵育30 min。用Nav1.7單克隆抗體( 150稀釋)孵育4 h，PBS沖洗5遍。用綠色熒光二抗37 ℃孵育1 h，然后4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗5遍。用Depi(1100稀釋)復染細胞核，3 min，用PBS沖洗5遍，-20 ℃保存，共聚焦顯微鏡拍照。實驗重復3次，每次結果選取10個細胞測定綠色熒光強度，結果取平均值。

1.5不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細胞SCN9AmRNA表達水平的RT-PCR檢測PC12細胞分別用0、5、10、20、40 nmol/L谷氨酸鈉培養14 h后，行SCN9A mRNA表達水平的RT-PCR檢測。引物見表1。①細胞總RNA的提取： 收集各組細胞，加入1 mL Trizol，室溫放置5 min，使細胞充分裂解。再用氯仿、異丙醇、乙醇等處理，提取總RNA。②逆轉錄合成cDNA：RNA 10 μL，Random 1 μL，5×反應緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，10 mol/L dNTP Mix 2 μL，逆轉錄酶1 μL。42 ℃ 60 min，最后70 ℃ 5 min，終止逆轉錄反應。③PCR擴增：反應總體系為20 μL。cDNA 2 μL，2×Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DEPC水7 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33個循環；最后72 ℃ 8 min。④PCR產物分析：10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Glyko Bandscan軟件分析。以SCN9A與內參照擴增產物的光密度值的比值表示SCN9A mRNA的表達水平。實驗重復3次。

表1 RT-PCR的引物

1.6不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細胞Nav1.7表達的Western-blot檢測PC12細胞分別用0、5、10、20 nmol/L的谷氨酸鈉培養14 h后，換成正常DMEM培養基再培養24 h。常規胰蛋白酶消化后將胰蛋白酶吸出，加入培養基將細胞吹打起來，收集細胞于EP管中，4 000 r/min離心5 min。用PBS洗3次，4 000 r/min離心5 min，棄上清加入細胞裂解液PMSF 500 μL，冰上孵育5～10 min，14 000 r/min離心 5 min，收集上清，100 ℃ 5 min。Bradford法測蛋白濃度。等量上樣后80 g/L分離膠電泳，110 V 90 min轉PVDF膜，體積分數5%脫脂奶封閉2 h,洗滌后加Nav1.7一抗(1400稀釋)，4 ℃過夜，TBST洗滌3遍后加二抗(11 000稀釋)室溫2 h,增強型發光劑ECL顯色，曝光。實驗重復3次，結果取目的條帶與β-actin條帶光密度的比值。

1.7統計學處理采用Graphpad Prism 5進行統計學分析，各組PC12細胞免疫熒光、RT-PCR、Western-blot結果的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組PC12細胞Nav1.7表達的免疫熒光檢測結果見圖1和表2。

圖1 各組PC12細胞Nav1.7的免疫熒光染色結果(×200)

表2 各組PC12細胞Nav1.7免疫熒光檢測結果

F=61.871,P<0.001；*:與對照組比較，P<0.05。

2.2各組PC12細胞SCN9AmRNA的表達水平

見圖2和表3。

2.3各組PC12細胞Nav1.7表達的Western-blot檢測結果見圖3和表4。

圖2 各組PC12細胞SCN9A mRNA表達的RT-PCR檢測結果

表3 各組PC12細胞SCN9A mRNA表達水平比較

F=11.821,P<0.001；*:與對照組比較，P<0.05。

圖3 各組PC12細胞Nav1.7的Western-blot檢測結果

表4 各組PC12細胞Western-blot檢測結果

F=23.274,P<0.001；*:與對照組比較，P<0.05。

3 討論

SCN9A表達于外周神經元及交感神經節，其單基因變異可導致3種與疼痛相關的遺傳性疾病。因此SCN9A有可能是研究疼痛的一把關鍵鑰匙[4]。有學者[5]觀察到Nav1.7與炎性痛的發生發展密切相關，而與神經病理性疼痛無關。參與慢性疼痛形成與發展的神經遞質有許多，其中興奮性氨基酸[主要是谷氨酸(Glu)]是介導痛覺信息傳遞最主要的神經遞質之一，以Glu為媒介的神經沖動傳遞誘發痛覺中樞產生高度興奮性是慢性疼痛形成的重要基礎[6]。Glu可以引起神經元興奮閾值降低、興奮性增高是慢性疼痛形成的重要起始因素。因此作者利用谷氨酸鈉刺激PC12細胞模擬疼痛刺激觀察細胞水平Nav1.7表達量的變化與疼痛刺激的關系。

PC12 細胞屬大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞系。通常它們在含血清的培養基中可增殖，在加入神經生長因子后細胞分化為交感神經元的形態[7]，因此用PC12代替神經節細胞研究Nav1.7的功能及在疼痛中的作用。

該實驗以PC12高分化細胞為實驗材料。用不同濃度谷氨酸鈉刺激細胞，建立細胞水平上的疼痛模型。作者用免疫熒光和RT-PCR的方法，檢測不同濃度谷氨酸鈉刺激后PC12細胞SCN9A基因和Nav1.7蛋白表達的變化，結果表明隨著疼痛刺激強度的增加，Nav1.7的表達也隨之增加。而谷氨酸鈉與炎性痛、神經病理性痛均密切相關，提示Nav1.7在疼痛的發生發展中起重要作用，該研究結果為疼痛的治療開辟了新的思路[8-10]。

[1]王云,楊勇,李頌.原發性紅斑性肢痛癥致病基因的定位及突變研究[J].中華皮膚科雜志, 2004, 37(7): 383

[2]Cox JJ, Reimann F, Nicholas AK, et al.An SCN9A channelopathy causes congenital inability to experience[J]. Nature, 2006,444(7121):894

[3]Lampert A, O’Reilly AO, Reeh P, et al.Sodium channelopathies and pain[J].Pflugers Arch, 2010,460(2):249

[4]Reimann F, Cox JJ,Belfer I, et al. Pain perception is altered by a nucleotide polymorphism in SCN9A[J]. Prco Natl Acad Sci USA, 2010,107(11):5148

[5]Nassar MA, Levato A, Wood JN. Neuropathic pain develops normally in mice lacking both Na(v)1.7 and Na(v)1.8[J]. Mol Pain, 2005, 1:24

[6]曹靖，王振全，任秀花，等.蛛網膜下腔移植APA-NIH3T3/rPENK對大鼠神經痛的鎮痛效應[J]. 鄭州大學學報：醫學版, 2009，44(2):374

[7]Cox JJ, Sheynin J, Shorer Z, et al.Congenital insensitivity to pain: novel SCN9A missense and in-frame deletion mutations[J]. Hum Mutat, 2010, 31(9):E1670

[8]Wang W, Gu J, Li YQ, et al.Are voltage-gated sodium channels on the dorsal root ganglion involved in the development of neuropathic pain? [J].Mol Pain,2011,7:16

[9]Goss JR, Gold MS, Glorioso JC. HSV vector-mediated modification of primary nociceptor afferents: an approach to inhibit chronic pain[J]. Gene Ther, 2009，16(4):493

[10]劉艷紅，張宏，徐龍河.大鼠骨癌痛模型的制備及電壓依賴性鈉通道Nav1.8在其背根神經節的表達研究[J].解放軍醫學雜志，2007,32(4):319