炎癥性腸病小鼠外周血和結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白的表達*

仝亞林，楊萬荷，李家群，李治國，李林靜，馮百歲

鄭州大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種病因和發(fā)病機制尚不清楚的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，該病在西方國家較為常見，但近年來我國IBD的發(fā)病率亦逐年升高[1-2]，成為醫(yī)學界研究的熱點及難點。近年來，免疫功能異常在IBD發(fā)病中的作用日益受到重視，但具體機制尚無明確定論[3-4]。CD98在胃腸道組織中高水平表達，可能是炎癥發(fā)生和持續(xù)化的重要因素之一[5]。作者應(yīng)用2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)誘發(fā)實驗性小鼠IBD模型，分別采用流式細胞術(shù)和免疫組織化學染色方法檢測小鼠外周血和結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白的表達，探討CD98與IBD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑和儀器SPF級雄性Balb/c小鼠48只，6～7周齡，體質(zhì)量18～25 g，購自河南省實驗動物中心。TNBS(Sigma公司)，F(xiàn)ITC標記和未標記的山羊抗小鼠CD98單克隆抗體(Santa Cruz公司)，紅細胞裂解液(北京鼎國生物科技有限公司)，流式細胞儀Epic-XLⅡ(美國 Beckmen Coulter公司)。

1.2實驗分組小鼠隨機分為正常對照組、生理鹽水組、乙醇組和TNBS+乙醇組，每組12只。正常對照組：自由飲食，不進行干預(yù)。生理鹽水組：禁食24 h，自由飲水，第1天100 μL生理鹽水灌腸后自由飲食，于第8、15天重復(fù)此操作。乙醇組：用體積分數(shù)50%乙醇溶液100 μL灌腸，方法和步驟同生理鹽水組。TNBS+乙醇組：第1天用2.0 mg TNBS加體積分數(shù)50%乙醇100 μL灌腸，第8天用2.5 mg TNBS加體積分數(shù)50%乙醇100 μL灌腸，第15天用3.0 mg TNBS加體積分數(shù)50%乙醇100 μL灌腸。TNBS+乙醇組小鼠在造模2～3 d時即出現(xiàn)少動、皮膚不光滑、體質(zhì)量減輕、肛周皮毛被糞便污染、腹瀉、便血等現(xiàn)象，并且以上現(xiàn)象可持續(xù)3周以上。

1.3取材實驗第21天，水合氯醛腹腔注射麻醉，用摘眼球法取血后處死小鼠并留取距肛門約5 cm處的結(jié)腸標本，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.4外周血CD98蛋白檢測外周血樣本加入紅細胞裂解液，離心并洗滌后，分別再加入FITC標記的山羊抗小鼠CD98單克隆抗體，利用流式細胞儀進行檢測。選用波長488 nm的氬離子激光，以“門技術(shù)”劃定淋巴細胞，測定每個標本門內(nèi)10 000個細胞。測定結(jié)果用Cellquest 3.0軟件(美國Becton-Dickinson公司)進行熒光參數(shù)的獲取和分析，記錄CD98陽性細胞占外周血細胞的百分比。

1.5結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白的表達采用免疫組化SABC法測定。取石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，滴加山羊抗小鼠CD98單克隆抗體(稀釋100倍)。4 ℃冰箱過夜，次日加入生物素二抗，DAB顯色，各步驟之間用PBS沖洗3次，每次5 min，依次脫水和封片,以PBS代替一抗作陰性對照，以已知陽性切片作陽性對照。均嚴格按試劑說明書步驟進行操作。結(jié)果判定：高倍鏡(×400)下選擇5個不重復(fù)視野觀察。陽性細胞百分比：0～25%為0分，～50%為1分，～75%為2分，>75%為3分。染色強度：輕度計為1分，中度著色計為2分，重度著色為3分。陽性判斷標準：以上兩項得分之和≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，4組外周血CD98蛋白表達的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白表達的比較應(yīng)用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組外周血CD98蛋白表達水平的比較見表1。

表1 4組外周血和結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白表達水平的比較

*：與其他各組比較，P<0.05。

2.2 4組結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白的表達見圖1、表1。

圖1 4組結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白的表達(SABC，×400)

3 討論

理想的動物模型是探究IBD病因、病理及藥物研發(fā)不可或缺的重要工具。TNBS是一種半抗原，只有在與組織蛋白等大分子物質(zhì)結(jié)合之后才能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生，其在體內(nèi)不能單獨誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，因此造模時需要先用乙醇破壞腸道黏膜屏障，TNBS隨之與腸道黏膜的角蛋白結(jié)合形成完全抗原，從而激發(fā)局部的免疫反應(yīng)。用TNBS+乙醇誘導(dǎo)的小鼠實驗性IBD模型是研究炎癥性腸病的經(jīng)典模型，灌腸后2～3 d即表現(xiàn)為急性炎癥狀態(tài)，3周左右進入慢性炎癥階段，其病理表現(xiàn)同臨床上的炎癥性腸病非常相似[4]。

目前認為，環(huán)境、遺傳、感染及免疫因素共同參與IBD的發(fā)病，其中免疫因素在IBD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[6]。在對IBD發(fā)病機制的研究中,包括整合素在內(nèi)的黏附分子參與的免疫反應(yīng)和炎癥過程是當前研究的熱點之一[7]。CD98是一個發(fā)現(xiàn)和研究時間不長的白細胞分化抗原，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，是由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵共價連接而成的異源二聚體[8]，可在除血小板以外的所有細胞表面表達，其序列和結(jié)構(gòu)在不同物種進化過程中高度保守[9]。目前認為CD98有調(diào)節(jié)β1整合素、氨基酸轉(zhuǎn)運及細胞融合與增殖等功能[10]。另外在維持腸道穩(wěn)態(tài)及固有免疫應(yīng)答中起著重要作用[11]，在腸道炎癥的發(fā)生中也發(fā)揮著一定作用[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，活化的CD98上調(diào)β1整合素的表達及其與胞外配合基的親和力，引起細胞黏附增加。另外，CD98可以使β1整合素聚集為高密度的復(fù)合物，導(dǎo)致整合素活化[14]，產(chǎn)生整合素樣信號傳導(dǎo)，從而引發(fā)細胞的極性、黏附等特性的改變[15]，促進腸道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

該研究結(jié)果顯示，TNBS+乙醇組外周血CD98表達水平和結(jié)腸上皮組織中CD98蛋白的表達均較其他各組升高，提示CD98可能是IBD致病和炎癥持續(xù)發(fā)生的重要因素。

綜上所述，CD98可能參與了IBD的發(fā)病和病情進展。

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