β-連環素對人羊膜間充質干細胞增殖的影響*

張一折，蘆俊萍，張東麗，梁 碩，遲連凱，趙永輝，王滿倉，何 濤，喬露華，田 毅，楊 波，馬 軒，關方霞#

1)鄭州大學生物工程系 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院神經外科 鄭州 450052

羊膜間充質干細胞(amniotic membrane derived mesenchymal stem cells，AMSC)是近年來備受關注的一種新型干細胞。它具有分離培養容易、增殖快、不受倫理學限制等優越性，同時呈現出低免疫原性與免疫抑制作用，體外誘導可以多向分化，是非常理想的干細胞來源。Wnt/β-連環素(β-catenin)信號是調控神經前體細胞譜系分化、神經發育及成體腦中再生神經元成熟的重要通路[1-2]，其中β-catenin的表達水平直接決定神經前體細胞(neural precursor cell，NPC)的增殖與分化[3]。Wnt屬分泌型糖蛋白，與細胞表面受體結合后，抑制細胞內糖原合成酶激酶-3β (GSK-3β) 活性，引起β-catenin在胞質內積累并進入細胞核，與淋巴樣增強因子/T細胞因子(LEF/TCF)結合，激活轉錄因子，誘導相應的靶基因c-myc、neurogenins、Neuro D等表達，從而對細胞增殖分化進行調節。近來研究[4-5]發現：β-catenin活化的骨髓間充質干細胞能刺激造血干細胞的增殖，改善干細胞微環境，穩定的β-catenin表達是長期維持造血干細胞更新的基礎。AMSC具有神經細胞生物學特性，能向神經元定向誘導。然而，β-catenin對AMSC增殖和分化的體內外調控作用尚不清楚。該實驗旨在構建介導AMSC β-catenin高表達的重組腺病毒載體，研究其對AMSC增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材料正常足月剖宮產胎兒的胎盤(鄭州大學第一附屬醫院婦產科提供)，HEK293細胞(鄭州大學基礎醫學院韓圣娜副教授惠贈)，pAd-β-catenin-GFP重組腺病毒(由鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室構建并保存)，DMEM/F12培養基(購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司)，胎牛血清(購自杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(購自Solarbio 公司)，鼠抗β-catenin 單克隆抗體、鼠抗GSK-3β單克隆抗體(均購自Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin 單克隆抗體、HRP 標記山羊抗小鼠二抗、蛋白質Marker(購自北京鼎國昌盛生物公司)。

1.2人AMSC的分離與培養無菌條件下取正常足月剖宮產胎兒的胎盤，鈍性分離胎盤臍帶面的羊膜約10 cm×10 cm，用PBS緩沖液充分沖洗，然后將羊膜盡可能剪碎，加入2.5 g/L的胰蛋白酶，37 ℃消化30 min，終止消化后將液體倒掉，再以終質量濃度為1.0 g/L 膠原酶37 ℃消化90 min。過200目不銹鋼網將消化下來的細胞制成單細胞懸液，1 300 r/min離心8 min收集細胞，接種于75 mL培養瓶內，置37 ℃培養箱中培養48～72 h后，更換培養液，棄去未貼壁的細胞，根據細胞生長情況，每3～4 d全量換液1次。待細胞達到80%～90%融合時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化。用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待細胞大部分胞體回縮、變圓，即終止消化，然后分為2～3份進行傳代接種培養，并記為P1代。傳代培養過程中每2～3 d全量換液，直至貼壁細胞彼此融合，鋪滿瓶底，再重復上述操作，傳代培養記為P2代，其余類推。取P3代以后細胞用于實驗操作。

1.3重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒的擴增、純化

HEK293細胞于75 mL培養瓶生長至豐度為70%左右時，以構建好的腺病毒原液5 μL進行感染，以未加腺病毒的正常培養細胞為對照。培養24 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化，并于熒光顯微鏡下觀察GFP的熒光現象。

1.4重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒感染AMSC后細胞生長狀態的測定AMSC鋪滿瓶底70%左右時，向75 mL培養瓶中加入100 μL腺病毒懸液，輕輕晃動瓶子，使混勻。以未加腺病毒的正常培養細胞作對照。感染24 h后，接種于96孔培養板，設3個復孔，接種后24 h采用CKK-8法測板，連測5 d。測定前每孔加入10 μL CKK-8溶液于37 ℃細胞培養箱繼續孵育2 h，使用多功能酶標儀在450 nm波長讀取吸光度值(A)并計算重組腺病毒穩定表達的AMSCs的增殖率。增殖率=(腺病毒感染組A值/對照組A值-1)×100%。

2 結果

2.1重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒的擴增重組腺病毒感染HEK293細胞24 h后，倒置相差顯微鏡下觀察細胞出現病變現象，主要變化為細胞偽足縮短、變圓、有部分細胞脫落，與對照組細胞形態明顯不同(圖1A和B)。同時熒光顯微鏡下能看到熒光現象(圖1C)。重組腺病毒在HEK293細胞中得以大量擴增。

圖1 HEK293細胞形態(×100)

2.2AMSCs中β-catenin表達的熒光檢測結果GFP標記的含β-catenin的重組腺病毒感染AMSC 48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察，發現感染組細胞與對照組細胞相比沒有明顯的形態變化，但數量上稍有增加(圖2A和B)，在熒光顯微鏡下能看到大量的熒光現象(圖2C)。

圖2 AMSC形態(×100)

2.3重組pAd-β-catenin-GFP腺病毒感染AMSC后細胞生長狀況的測定結果結果顯示,第1～5天，β-catenin穩定高表達的AMSCs增殖率分別為50.0%、82.5%、92.6%、169.1%和128.2%，明顯高于正常的AMSCs，說明高表達的β-catenin能有效地刺激AMSCs的增殖。

3 討論

β-catenin在胞質中的含量升高積累，促使它可以進一步移位至細胞核內與T細胞因子形成復合物，從而激活Wnt靶基因的轉錄，調控細胞生長；另外，β-catenin在胞質內可與鈣粘素和細胞骨架蛋白結合維持其穩定性，β-catenin的表達水平決定神經系統中NPC和神經干細胞(neural stem cell，NSC)的增殖與分化[6]。

臍血間充質干細胞、經血間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、神經干細胞向神經元分化以及胚胎干細胞的早期增殖與Wnt 信號通路有關[7]，而關于AMSC增殖、分化調控的明確機制無相關文獻報道。

β-catenin作為Wnt 信號途徑的關鍵成員，通過正、負反饋調節干細胞的數量，在內外因素中都發揮著重要的作用[8-9]。細胞內游離β-catenin在沒有Wnt 信號刺激的情況下很容易被胞內降解系統所降解，極不穩定，細胞中僅有少量的β-catenin以保證正常細胞的生理生化功能，不至于成瘤化[10]，所以引入外源的β-catenin或阻礙胞質內β-catenin的磷酸化與降解，都可以進一步促使β-catenin在胞質內的積累，達到一定量后進入細胞核。從某種程度上來說β-catenin的入核意味著Wnt/β-catenin信號通路的激活。β-catenin作為把核外信號傳遞到核內的信號蛋白，在Wnt信號通路中處于關鍵地位，該蛋白的表達水平直接影響Wnt信號通路的生物學效應。

GFP能夠在紫外線的激發下發出明亮的綠色熒光[11]，被認為是一種理想的報道基因，是研究細胞基因表達和表達產物分布的最好工具[12]。作者將GFP基因融合在β-catenin基因的5’端，既保留了β-catenin的轉錄激活功能，又能通過GFP直接觀察β-catenin在活細胞內的分布和表達。

腺病毒載體能夠感染多種哺乳動物細胞，宿主范圍廣，包裝容量大，對人致病性低，攜帶的外源基因在靶細胞內以附加體形式存在，并不整合到宿主染色體中，具有極低的插入突變危險性和較低的遺傳毒性；轉移效率高，容量大，無需輔助病毒，可插入外源基因的片段達7～8 kb；對于細胞是否處于分裂期無嚴格要求，能夠在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因；同時制備簡單，可以通過超離心得到高滴度的病毒[13]。

該研究通過建立GFP標記、重組腺病毒載體介導β-catenin高表達的AMSC和體外調控β-catenin的表達，研究了經典Wnt信號通路中的β-catenin對AMSC增殖的影響。通過熒光顯微鏡檢測顯示pAd-β-catenin-GFP重組腺病毒感染AMSC后，外源β-catenin于AMSC中成功表達，且外源β-catenin對AMSC的增殖有促進作用，明顯高于對照組。

總之，該研究為了解β-catenin在AMSC細胞增殖和分化中的調節作用提供了實驗支持，并為優化AMSC在中樞神經性疾病中的臨床治療效果奠定了重要的實驗基礎。

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